| Livestock Research for Rural Development 27 (5) 2015 | Guide for preparation of papers | LRRD Newsletter | Citation of this paper |
Un dosage sérologique des glycoprotéines associées à la gestation chez les caprins (caPAG), par la technique ELISA "sandwich" a été mis au point pour le diagnostic précoce de la gestation chez la chèvre naine de Guinée. Des anticorps anti-caPAG produits chez les lapins ont été biotinylés et titrés pour permettre ce dosage dans le sérum de chèvres. Des échantillons de sang ont été collectés tous les 7 jours chez 6 chèvres après induction et synchronisation des chaleurs puis saillie pour doser la caPAG sérique. Les densités optiques ont été lues à 492 nm sur un lecteur automatique ELISA pour établie le profil de la caPAG.
Le taux de caPAG augmente rapidement pendant le premier tiers de gestation pour atteindre un pic (117 ng/ml) vers le 91e jour puis baisse pour atteindre environ 50 ng/ml le 121ème jour et reste plus ou moins stable jusqu’à la parturition où il chute progressivement pour atteindre environ 12,5 ng/ml trois semaines après. Cependant ce taux reste encore élevé dans la circulation maternelle 3 semaines après la parturition. La PAG caprine est détectable dans le sérum par cette technique à partir du 28ème jour de gestation avec une sensibilité de 100 %. Le 21ème jour, la sensibilité est faible (66,7 %). Ce test offre donc une alternative pratique au laboratoire, précoce et fiable pour le diagnostic de la gestation à partir du jour 28 après insémination chez la chèvre naine de Guinée.
Mots clés: glycoprotéine associée à la gestation, diagnostic de gestation, ELISA- sandwich, caPAG, Cameroun
A serological assay based on the detection of goat pregnancy associated glycoprotein (caPAG) by the sandwich-ELISA method was designed and carried out on serum of African dwarf goat in other to develop an early pregnancy diagnosis. For this purpose, the anti-caPAG antibodies produced in rabbits were biotinylated and titrated for the development of the ELISA "sandwich" assay for the caPAG detection in the goat serum.
Blood samples were collected every seven days from six African dwarf goats after induction, synchronization of estrus and projection. Sera obtained have served in serological assay by ELISA "Sandwich". The optical densities read at 492 nm on an ELISA automatic reader has served to establish the profiles of the caPAG.
Pregnancy associated glycoprotein’s rate increases rapidly during the first third of pregnancy to a peak corresponding to a concentration of 117 ng / ml at day 91 of gestation. This concentration then drops to reach about 50 ng / ml the 121st day and remains more or less stable until parturition where it gradually drops to baseline values. However, three weeks after parturition, the rate of PAG is still high in the maternal circulation. Goat PAG is detectable in the maternal circulation of pregnant African dwarf goats by ELISA "sandwich" from day 28 after fertilization with sensitivity of 100%. Between days 14 and 21 the sensitivities are low and are respectively of 33.3 % and 66.7 %.
This sandwich ELISA gives a reliable laboratory test and convenient alternative for an early pregnancy diagnosis from day 28 after insemination. It is therefore a major step forward for early diagnosis of pregnancy in goats.
Keywords: pregnancy associated glycoproteins, early diagnosis, pregnancy, ELISA sandwich, goat
La détection précoce et fiable de la gestation dans les élevages en général et chez les petits ruminants en particulier est un élément essentiel du suivi de la reproduction (Barbry et al 2013). Au Cameroun, l’élevage de ces petits ruminants constitue l’une des principales activités des ménages ruraux (Manjeli et al 1996). Cependant, malgré des efforts de développement et de recherche pour la promotion de cet élevage, on note un faible accroissement de la production du troupeau(2,39 % par an) (MINEPIA 2011). Cette faible croissance est due aux principales contraintes de production parmi lesquelles, le climat, les maladies (endoparasites et ectoparasites), la mortalité des jeunes à la naissance et pendant la période post-sevrage (Duboeuf 2011), la difficulté d’accès à l’information, à la formation et aux intrants par les éleveurs (Bonfoh et Bassowa 2005 ; Ibrahim et Ololaku 2000). Outre ces contraintes, il faut noter la non disponibilité d’une méthode efficace et pratique de diagnostic précoce de la gestation dont une des conséquences est l’abattage de femelles gravides.
C’est pourquoi notre étude consiste à la mise au point et à l´évaluation d'un test ELISA- sandwich pour le diagnostic précoce de la gestation chez la chèvre naine de Guinée par la détection, dans le sang maternel, des glycoprotéines associées à la gestation (PAG). Parmi la vingtaine de PAG connues et sécrétées durant différentes périodes de la gestation (Green et al 2000), ce test en détecte un panel dit « précoce » et de demi-vie courte.
L’étude a été menée à la ferme d’application et de recherche (FAR), et au Laboratoire de santé animale (LASAN) de la Faculté d’Agronomie et des Sciences Agricoles de l’Université de Dschang, située à l’ouest du Cameroun.
Six chèvres naines de Guinée et deux boucs âgés de 2 à 3 ans et pesant en moyenne 22 kg ont été suivis à la Ferme d’Application et de Recherche (FAR) de l’Université de Dschang.
Les animaux ont eu une période d’adaptation de quatre semaines pendant laquelle ils ont été identifiés, pesés, vaccinés contre la peste des petits ruminants et déparasités. Une estimation de leur âge a également été faite à partir de la table dentaire.
Pour la synchronisation des chaleurs, une éponge vaginale de médroxyprogestérone (VERAMIX® Upjohn) recouverte d’une fine couche de crème antiseptique, a été introduite dans le vagin de la chèvre (chaque éponge contient 60 mg d’acétate de médroxyprogestérone), laissant pendre en dehors de la vulve, et sur une longueur d’environ 3 cm, le fil fixé au bout de l’éponge. Le retrait de l’éponge progestative a été effectué 13 jours plus tard, et une injection intra musculaire de gonadotrophine sérique (Folligon®, Intervet) a été faite à une dose de 500 UI par femelle.
Après avoir administré du Folligon® aux femelles, les mâles marqués à l’encre ont été introduits dans les loges des femelles pour la saillie. Les mâles ont été maintenus pendant un mois avec les femelles, afin de détecter des éventuelles saillies infructueuses. Du sang a été ensuite systématiquement collecté sur chaque chèvre. Les prises de sang hebdomadaires ont été effectuées par ponction de la veine jugulaire, dans des tubes Venoject sous vide de 10 ml et étiquetés. Le prélèvement des échantillons témoins a été effectué chez les mâles. Tous les prélèvements ont été effectués entre janvier et juin 2013.
Le sang obtenu a été laissé à la température ambiante pendant une période de 12 à 24 heures, et le sérum recueilli a été conservé dans les tubes à hémolyse à -20°C jusqu’au moment des analyses.
La purification de la PAG chez la chèvre naine de Guinée a été faite selon la méthode décrite par Zoli et al (1991), modifiée par Garbayo et al (1998) avec de légères modifications. Pour cela, nous avons procédé à l’extraction de la caPAG et au fractionnement au sulfate d’ammonium, à la chromatographie sur DEAE-cellulose, à l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence du SDS (Sodium dodecyl Sulfate), au western blot et à l’extraction de la protéine des gels. L´extraction de la protéine des gels n´a pas été faite par Garbayo et al (1998).
Pour extraire la caPAG du gel, une série d´électrophorèses sur gel de polyacrylamide en présence de SDS a été faite avec des gels de 12% et de 2 mm d´épaisseur et constitué de 2 puits : un petit puits pour le marqueur de poids moléculaires et un grand puits pour l´échantillon. Après la migration, le gel a été retiré de la cuve, 1/5ième de celui-ci (coupé dans le sens de la verticale) a été coloré au bleu de coomassie G-250 et décoloré. La bande visible sur la partie du gel colorée a servi de repère pour couper la bande de la caPAG sur la partie du gel non coloré. Cette bande contenant la caPAG a été ensuite broyée à l´aide d´un mortier et d´un pilon de laboratoire, émulsifiée dans du PBS et laissée à 4°C pendant la nuit. Le lendemain la solution a été laissée sous légère agitation pendant 30 minutes, et centrifugée à 2500 tr/min à 4°C à l´aide d´une centrifugeuse UNIVERSAL # 32R. Le surnageant a été ensuite recueilli, concentré avec du Séphadex® G-200-120, dialysé, lyophilisé et conservé au réfrigérateur pour une utilisation ultérieure.
L’immuno-caractérisation a permis de déterminer le caractère immunogène de la PAG purifiée. Elle a été faite à travers la production des anticorps, comme décrite par Vaitukaiski et al., (1971) et modifiée par Butler et al., (1982).
L’immunogénécité de la PAG purifiée a été vérifiée en analysant le sérum prélevé chez les lapins par la technique de la double immuno-diffusion (Garbayo et al 1998).
Pour mettre au point la méthode immuno-enzymatique ELISA pour le diagnostic de gestation chez les caprins, nous avons procédé au préalable à la biotinylation des anticorps et à leur titration. Les anticorps contenus dans les antisérums issus des lapins immunisés ont été précipités au sulfate d’ammonium. Ces immunoglobulines G (IgG) ont été biotinylées à l’aide d’un kit, Biotin Labelling Kit (Roche), selon les indications du fabricant.
Des dilutions en série des anticorps marqués à la biotine ou non ont permis de retenir les taux de dilution devant servir aux différentes analyses par ELISA.
Brièvement, une plaque de microtitration (Costar 96-Well Vinyl) a été incubée à 37°C pendant 30 minutes avec 100 µl par puits d’anticorps anti-caPAG biotinylés dilués en série dans le tampon carbonate (Na2CO3 + NaHCO3, pH 9,6 0,06M). Les dilutions allaient de 1/500 à 1/16000. Ensuite le contenu de la plaque a été vidé et la plaque lavée 5 fois avec du PBS-Tween 20 (Phosphate buffer saline tween 20) ; puis incubée avec le tampon de blocage (150 µl par puits de BSA 2%) à 37°C pendant 30 minutes. La plaque a ensuite été vidée de son contenu et directement incubée avec le conjugué strepavidine-peroxydase dilué 1/5 000 pendant 30 min à 37°C. Après avoir été de nouveau vidée de son contenu et lavée 5 fois, la plaque a été incubée avec le substrat de la peroxydase (Ortho Phényl Diamine plus de l’eau oxygénée) à la température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 10 minutes. La réaction a été arrêtée par distribution de 30 µl par puits d’acide sulfurique (H2SO4 1N). Après observation de la coloration, la dilution adéquate a été retenue pour les analyses.
Pour les anticorps anti-caPAG non biotinylés, une plaque de microtitration a été incubée avec 100 µl par puits d’anticorps anti-caPAG non biotinylés à la dilution en série de 1/500 à 1/30 000 dans le tampon carbonate. La durée de l’incubation était de 30 minutes à la température de 37°C sous légère agitation. La plaque a été vidée de son contenu, lavée avec du PBS-Tween 20, puis incubée avec 150 µl par puits de tampon de blocage (Bovine serum albumin 2% dans du PBS) à 37°C pendant 30 minutes. Ensuite la plaque a été vidée de son contenu et incubée avec 100 µl par puits de caPAG de concentration connue (25 et 50 ng/ml) pendant 1 heure à 37°C. Après lavage comme indiqué plus haut, la plaque a été incubée avec de l’anticorps anti-caPAG biotinylé à la dilution de 1/1000, pendant 30 minutes et à 37°C. La suite était identique à la titration des anticorps biotinylés.
Pour l’établissement de la courbe standard, une plaque immuno-adsorbante a été sensibilisée avec 100 µl par puits de l’anticorps anti caPAG non biotinylé dilué à 1/4000 dans le tampon carbonate et incubée à 37°C pendant 30 minutes sous légère agitation. La plaque a été vidée de son contenu et lavée 5 fois avec le tampon de lavage (PBS Tween 20). Le tampon de blocage (BSA 2%) a été distribué ensuite sur la plaque à raison de 200 µl par puits. La plaque a été incubée pendant 30 minutes à 37°C, vidée de son contenu et incubée avec 100 µl par puits d’antigène caprin (caPAG) dilué en série dans du BSA 2% (250 ng/ml à 0 ng/ml). L’incubation a été effectuée à 37°C pendant 1 heure. Après avoir vidé et lavé la plaque tel que décrit plus haut, celle-ci a été incubée avec 100 µl par puits d’anticorps biotinylé dilué 1/2000 dans le tampon de blocage pendant 30 minutes à 37 °C. La plaque a été ensuite vidée, lavée comme indiqué plus haut et 100 µl par puits de conjugué (strepavidine -peroxydase) ont été distribués par puits et la plaque a été incubée à 37°C pendant 30 minutes. La plaque a été ensuite vidée et lavée comme indiqué plus haut et incubée avec 100 µl de substrat de la peroxydase à température ambiante pendant 10 minutes à l’abri de la lumière. La réaction a été arrêtée comme indiqué plus haut. Les densités optiques ont été lues sur un lecteur ELISA à la longueur d’onde de 492 nm et ont servi à l’établissement de la courbe standard.
Le dosage de la PAG par le test mis sur pied a été fait dans les sérums des chèvres naines de Guinée. Ceci nous a permis d´établir le profil de la PAG chez la chèvre naine de Guinée, de déterminer la précocité et la sensibilité du test pour le diagnostic de gestation chez cette espèce. Le profil de la caPAG pendant la gestation, a été présenté sous la forme d’une courbe, en exprimant les concentrations de PAG obtenues suite au dosage sérologique, en fonction des jours de prélèvement. Un sérum est déclaré positif au test si la densité optique de l’échantillon est supérieure ou égale à la moyenne des densités optiques des contrôles négatifs plus trois fois l’écart-type. C´est le seuil de positivité.
La sensibilité du test de gestation a été calculée à partir de la formule suivante (El Amirri et al 2003):
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Profil d’élution de la caPAG par chromatographie d’échange d’ion sur DEAE-cellulose Plusieurs protéines ont été décrochées et à différents gradients d’élution de Tris-Nacl (40 mM, 80 mM, 100 mM, 200 mM, 1000 mM), cependant, la caPAG a été décrochée en grande quantité avec le gradient 200 mM et on observe un pic à la 37ème fraction collectée au cours de l’élution (Figure 1).
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| Figure 1. Profil d’élution de la caPAG des cotylédons de chèvre sur DEAE-cellulose |
L’anticorps obtenu par immunisation des lapins (puits 2 et 3) reconnaît l’antigène qui lui a donné naissance (puits 1), d´où la formation d’un précipité qui se présente sous la forme d’une ligne blanchâtre visible à l’œil nu (Figure 2).
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Figure 2 : Double immuno diffusion : 1 = caPAG purifiée, 2 et 3 = Sérum lapin contenant l’anticorps anti caPAG, 4 = Albumine sérique bovine |
Les densités optiques sont proportionnelles à la concentration de l’anticorps froids. Entre la dilution 1/500 et 1/4 000, les densités optiques sont plus ou moins constantes. La dilution 1/4 000 a été donc retenue pour les dosages sériques (Figure 3 A). Pour ce qui est des anticorps biotinylés, les densités optiques évoluent graduellement jusqu’à la dilution 1/2 000 ou elles commencent à se stabiliser pour former un plateau. La dilution 1/2 000 a été donc retenue pour les dosages sériques (Figure 3 B).
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Figure 3: Courbe de titration anticorps anti caPAG froid (A) et biotinylé (B) |
La courbe standard a permis de projeter les densités optiques pour obtenir les concentrations de caPAG contenues dans les sérums, afin d’établir le profil de la PAG chez la chèvre naine de Guinée pendant la gestation (Figure 4). Ces densités optiques sont proportionnelles à la quantité de caPAG. Plus la quantité est grande, plus grande est la densité optique d’où la tendance exponentielle de la courbe avec une équation de régression y = 0,618e 0, 004x.
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| Figure 4. Curbe estandard de la caPAG |
Après la saillie, le taux de PAG augmente rapidement entre la 3ième et la 13ième semaine de gestation pour atteindre un pic correspondant à une concentration de 117 ng/ml vers le jour 91 de la gestation. Cette concentration baisse pour atteindre environ 50 ng/ml le 121 ème jour et reste plus ou moins stable jusqu’à la parturition où elle chute rapidement pour atteindre environ de 12,5 ng/ml 3 semaines après (Figure 5). Cependant 3 semaines après la parturition, le taux de reste encore élevé dans la circulation maternelle.
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| Figure 5. Profil moyen de la CaPAG chez la chévre naine de Guinée pendant la gestation |
La PAG caprine est détectable dans la circulation maternelle (sérum sanguin) des chèvres naines de Guinée gestantes par la technique ELISA « sandwich » à partir du jour 28 après fécondation avec une sensibilité de 100 % donc avec certitude (Tableau 1). Entre les jours 14 et 21 les sensibilités sont faibles et sont respectivement de 33,3 % et 66,7 %. La sensibilité est donc fonction du moment de la gestation.
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Tableau 1 : Sensibilité du test |
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Jours de gestation |
Sensibilité (%) |
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14 |
33,3 |
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21 |
66,7 |
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28 |
100 |
Les fractions de protéines éluées sur DEAE- cellulose avec le tampon Tris-Hcl de forces ioniques 0,02, 0,04, 0,08, 0,1, 0,2, et 1 M de Nacl étaient immuno réactives. Cependant, le taux d’immuno réactivité le plus élevé a été obtenu avec le gradient 0,2 M. Garbayo et al (1998) ont isolé les cotylédons fœtaux des chèvres alpines et ont eu des taux d’immuno réactivité élevé avec les forces ioniques de NaCl moins élevées (0,04 et 0,08 M). La double immuno diffusion indique que la protéine purifiée est distincte de l’albumine sérique caprine (cSA) (Garbayo et al 2000). L’extraction de la PAG caprine des gels issus du SDS-PAGE permet donc d’obtenir une protéine avec moins de contamination.
L’obtention de la protéine semi-purifiée a permis la production d’un antisérum spécifique qui a servi au développement d’un dosage immuno enzymatique (ELISA- sandwich) pour la détection de la caPAG dans la circulation maternelle des chèvres en vue d’un diagnostic précoce de la gestation. Le dosage sérologique de la PAG montre que le profil de la PAG chez les chèvres naines de Guinée a une allure qui varie au long de la gestation. Au début de la gestation (1er tiers de la gestation), il y a une augmentation rapide du taux de PAG jusqu’à une concentration maximale 117ng/ml le jour 91 de gestation. Ce taux va décroître ensuite pour atteindre environ 50 ng/ml vers le 121ième jour. Cette allure est plus ou moins comparable à celle obtenue par Sousa et al (1997). Cependant, il a obtenu les concentrations maximales de 123 ng/ml le jour 54 et cette concentration diminue ensuite pour atteindre 45,45 ng/ml aux environs de la 9ème semaine. Par ailleurs, Barbato et al (2013) confirme que la concentration de PAG augmente rapidement en début de gestation chez les petits ruminants ce qui n’est pas le cas chez les bovins.
Trois semaines après la parturition, le taux de PAG reste encore au dessus du seuil de positivité. Ceci s’explique par le fait qu’après le part, le taux de la protéine baisse lentement et à 3 semaines post partum, ce taux n’atteint pas encore le taux de base. Il a été noté que chez les brebis, le niveau de la PAG diminuait pour atteindre les valeurs basales après la 4ème semaine post partum (El Amiri et al 2003) et au delà de 6 semaines chez la vache (Breukelman et al 2012, Zoli et al 1992).
La sensibilité du test de gestation ELISA sandwich pour le dosage de la caPAG varie en fonction du moment de la gestation et est respectivement de 33,3% le 14ème jour après la fécondation, 66,7 % le 21éme jour, et 100% le 28ème jour. Gonzalez et al (2001) ont obtenu par RIA des sensibilités plus élevées de 94,4% le 22ème jour et 100% le 26ème jour de la gestation. Par ailleurs Beckers (1999) a obtenu des sensibilités de 100% le jour 21 de la gestation et Barbry et al (2012) ont récemment obtenus le 29ième jour des sensibilités respectives de 100% et 98% en dosant la PAG dans le sérum et le lait des vaches gestantes. Alors la sensibilité que nous avons obtenue montre que ce test est moins précoce que celui réalisé par Beckers (1999) et Gonzalez et al (2001) mais plus précoce que celui de Barbry et al (2012). Ces légères différences peuvent être dues non seulement aux variations individuelles, mais également à la technique utilisée car ces auteurs ont utilisé la technique RIA.
En outre, le dosage sérologique de la PAG chez la chèvre naine de Guinée est moins précoce que celui du dosage de la progestérone (21ème jour) mais ce dernier nécessite la connaissance de la date de saillie (El Amiri et al 2004). Cependant il est plus précoce que celui du dosage du sulfate d’œstrone et de l’hormone lactogène placentaire qui sont détectables dans la circulation maternelle des petits ruminants respectivement à partir du jour 40 et 44 de la gestation (Zarrouk et al., 2001).
Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire de santé animale de la Faculté d’Agronomie et des Sciences Agricoles (FASA) de l’Université de Dschang/Cameroun pour avoir facilité la réalisation de ce travail.
Barbato O , Sousa N M, Vittoria L B, Canali C and Beckers J F 2013 Purification of pregnancy-associated glycoproteins from late-pregnancy Bubalus bubalis placentas and development of a radioimmunoassay for pregnancy diagnosis in water buffalo females. BMC Veterinary Research. 9, 89 doi: 10.1186/1746-6148-9-89.
Barbry J B, Velek K, Pun S, Rice A, Egli C, Leterme S et Commun L 2013 Diagnostic précoce de la gestation chez le bovin : un nouveau test à réaliser sur le sang ou le lait. Renc. Rech. Ruminants, 19.
Beckers J F, Roberts RM, Zoli A P, Ectors F et Derivaux J 1994 Molécules de la famille des Protéases aspartiques dans le placenta des ruminants : hormones ou protéines ? Bulletins et mémoire de lAcadémie royale de médecine de Belgique. Palais des académies. 149, 355-367.
Berkers J F 1999 Protéines associées à la gestation chez les ruminants: Biomarqueurs au service du diagnostic. Ann. Med. Vet. 143,253-263.
Breukelman S P, Perényi Z, Taverne M A, Jonker H, van der Weijden G C, Vos P L, de Ruigh L, Dieleman S J, Beckers J F and Szenci O 2012 Characterisation of pregnancy losses after embryo transfer by measuring plasma progesterone and bovine pregnancy-associated glycoprotein-1 concentrations. Vet J, 194, 71-76.
Bonfoh B et Bassowa H 2005 Elevage des ovins et des caprins au Togo. CRA-SH/ ITRA: 35- 54.
Butler H L, Hamilton W C , Sasser R G, Ruder C A, Hass G M and Williams R J 1982 Detection and partial characterization of two bovine pregnancy specific proteins. Biol. Reprod. 26: 925-933.
Duboeuf J P 2011 The social and environmental challenges faced by goat and small livestock local activities: Present contribution of research development and stakes for the future. Small Rum. Res, 98, 3-8.
El Amiri B, Remy B, Sousa N M, Joris B, Otthiers N G, Perenyi Z, Banga Mboko H and Beckers J F 2003 Isolation and partial characterization of three pregnancy-associated glycoproteins from ewe placenta. Mol Reprod Dev. 64,199-206.
El Amiri B, Remy B, De Sousa N M, Beckers J F 2004 Isolation and characterization of eight pregnancy-associated glycoproteins present at high levels in the ovine placenta between day 60 and day 100 of gestation.Reprod Nutr Dev. 44,169-181.
Garbayo J M, Benoit R, Jose L A, Jose F, Ruddy W, Paul F and Beckers J F 1998 Isolation and Partial Characterization of a Pregnancy-Associated Glycoprotein Family from the Goat Placenta. Biology of reproduction 58, 109-115
Garbayo J M, Green J A, Manikklam M, Beckers J F, Kiesling D O, Ealy A D and Roberts R M 2000 Caprine pregnancy-associated glycoprotein (PAG): their cloning, expression and evolutionary relationship to other PAG. Mol Reprod Dev. 57,311-322.
Green J A, Xie S, Quan X, Bao B, Gan X, Mathialogan N, Beckers J F, Roberts R M 2000 Pregnancy-associated bovine and ovine glycoproteins exhibit spatially and temporally distinct expression patterns during pregnancy. Biol Reprod. 62,1624-1631.
Ibrahim H and Olaloku E 2000 Improving cattle for milk, meat and traction. ILRI Manual 4, Nairobi, Kenya, 7pp.
Manjeli Y, Njwe R M, Tchoumboué J, Abba S et Teguia A 1996 Evaluation des pertes de chevreaux par abattage des femelles gravides. Rev. Elev. Med. vét. Pays trop. 4 :3, 253-255.
MINEPIA 2011 Etude du secteur élevage au Cameroun, CEPER, Yaoundé.
Sousa N M, Figueiredo J R, Goncalves B D P and Beckers J F 1997 Placental proteins in mammals. Animal Science. 7,1, 43-55.
Vaitukaitis J, Robbins J B, Nieschlag E and Ross G T 1971 A method for producing specific antisera with small doses of immunogen. J Clin Endocrinol Metab. 33,988-991.
Zoli A P, Berckers J F, Patricia U B, Classet J, Falmagne P and Ectors F 1991 Purification and characterization of a bovine pregnancy-associated glycol-protein., Biology of Reproduction. 45, 1-10.
Received 15 March 2015; Accepted 20 March 2015; Published 1 May 2015