Livestock Research for Rural Development 24 (5) 2012 Guide for preparation of papers LRRD Newsletter

Citation of this paper

Evaluación genética de la población caprina de Antioquia, usando marcadores microsatélites

S J Calvo#, M I Gonzáles#, P A Ángel, M F Cerón-Muñoz y H Cardona-Cadavid

Grupo de Investigación en Genética, Mejoramiento y Modelación Animal GaMMA, Facultad de Ciencias Agrarias e Instituto de Biología,
Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia
# Igual contribución.
henrycadavid@gmail.com

Resumen

El objetivo de este trabajo fue estimar la variabilidad genética de la población caprina de Antioquia Colombia, por medio de marcadores moleculares. Se utilizaron muestras de sangre de 626 cabras pertenecientes a 14 apriscos, las cuales fueron analizadas para los marcadores BM1329, BM1818, BM1824, BM6526, CSSM31, ETH10, ETH225, ILSTS005, ILSTS011, INRA006, INRA064, MAF065 y SPS115. El marcador BM1824 fue monomórfico y los otros marcadores variaron entre cinco (ETH225 y SPS225) y 20 alelos (BM6526 y MAF65).

 

Se presentó en la población una alta proporción de heterocigotos. El índice del contenido de información polimórfica (PIC) fue superior a 0.50 (entre 0.67 a 0.91) en ocho marcadores, por lo tanto, la población de cabras de Antioquia tiene una alta variabilidad genética. El panel básico de marcadores estudiados presentó una probabilidad de exclusión (PE) para el total de microsatélites superior al 99.99%, lo cual indica la utilidad de este conjunto de marcadores para pruebas de parentesco en esta especie.

Palabras claves: Capra hircus, PCR, probabilidad de exclusión, variabilidad genética



Genetic evaluation of the goat population of Antioquia, using microsatellite markers

Abstract

The objective of this study was to estimate the genetic variability of the goat population of Antioquia Colombia, using heterologous molecular markers. Six-hundred and twenty-six goat blood samples of 14 folds were analyzed for BM1329, BM1818, BM1824, BM6526, CSSM31, ETH10, ETH225, ILSTS005, ILSTS011, INRA006, INRA064, MAF065 and SPS115 microsatellites. The BM1824 was monomorphic and the others markers ranged from five (ETH225 and SPS225) to 20 alleles (BM6526 and MAF65).

The goat population presented a high proportion of heterozygotes. The polymorphic information content (PIC) index was higher than 0.50 (from 0.67 to 0.91) in eight markers: Therefore, the goat population of Antioquia has a high genetic variability. The base panel of markers showed a probability of exclusion (PE) greater than 99.99% for all microsatellites, which indicates the usefulness of this set of markers for parentage testing in this specie

Keywords: Capra hircus, exclusion probability, genetic variability, PCR


Introducción

Las cabras se han distribuido a lo largo de diferentes zonas agroecológicas del mundo, convirtiéndose en una buena alternativa de producción animal. En Colombia, la población caprina es de aproximadamente 1`491.187 animales concentrados en su mayoría en el departamento de la Guajira, con una población total de 938.703 animales, mientras que  Antioquia cuenta con 4.162 cabras (ICA 2010). Las poblaciones caprinas presentes en Colombia son descendientes de las primeras cabras introducidas al país en la época de la conquista, y aunque se dice que en Colombia existen razas bien identificadas como la Saanen, Alpina, Toggenburg, además de las consideradas como criollas o autóctonas, todavía no se tiene certeza de la diversidad, parentesco o pureza de los animales que conforman el inventario caprino del país (Espinal et al 2006).

En Colombia son pocos los trabajos realizados con marcadores moleculares en esta especie, al igual que no se lleva un registro genealógico eficiente en la población antioqueña para el control de apareamientos; lo cual se ha visto reflejado en la mezcla progresiva de los tipos raciales conocidos en el departamento a través de varias generaciones y que trae como consecuencia el desconocimiento del origen, composición y naturaleza racial de las poblaciones de Antioquia. Por otro lado, la selección indirecta realizada teniendo en cuenta solo la eficiencia productiva o el desempeño fenotípico de los animales, puede desencadenar a mediano o largo plazo una disminución progresiva de la diversidad genética de la población, un aumento de la endogamia y la no diferenciación genética entre y dentro de las sub-poblaciones (apriscos) como también entre y dentro de la población en general.

Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue caracterizar genéticamente la población caprina presente en el departamento de Antioquia utilizando 12 marcadores microsatélites (STR`s), con el fin de conocer y analizar la estructura y diversidad genética de esta población, además de evaluar y definir un panel de marcadores moleculares para la consecución de pruebas de filiación y paternidad que puedan ser una herramienta para el mantenimiento y la planeación de programas de cruzamiento y mejora genética a futuro. 

Materiales y métodos

Se muestrearon 626 cabras pertenecientes a 14 apriscos adscritos a la Asociación de Caprinovinocultores de Antioquia (ASOCABRA) y a productores independientes, ubicadas en los municipios de Copacabana (2), Carmen de Viboral (1), Rionegro (1), El retiro (1), Medellín (1), Porce (1), Envigado (1), La ceja (3), Caldas (1), Sopetran (1) y Barbosa (1) del departamento de Antioquia, Colombia. Las cabras no pertenecían a razas puras y no existían registros que pudieran determinar su origen racial o proporción de mezcla, por lo cual toda la población fue caracterizada como cabra mestiza (Figura 1). 

Figura 1: Población caprina característica en los apriscos de Antioquia, Colombia.

Se colectó, de cada individuo, 5 ml de sangre en tubos Vacutainer con anticoagulante EDTA, mediante punción de la vena yugular y posteriormente las muestras fueron procesadas en el laboratorio del grupo de investigación en Genética, Mejoramiento y Modelación Animal, GaMMA de la Universidad de Antioquia. El ADN se extrajo por el método Salting Out, reportado por Miller et al (1988). El ADN fue almacenado a 4°C, hasta su posterior cuantificación, la cual se realizó en un Nanodrop 2000c (Thermo Scientific®) y se diluyó la totalidad de las muestras de ADN a una concentración final de 50 ng/µl.

Se amplificaron 13 loci microsatélites ubicados en diferentes cromosomas del genoma caprino, mediante la técnica de PCR descrito por Mullis y Faloona (1987). Estos marcadores fueron tomados de la ISAG (International Society for Animal Genetic, 2005), recomendados para estudios de paternidad en cabras, vacunos y ovejas. La localización cromosómica y la secuencia de los cebadores se presentan en la Tabla 1. 

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 15 µl, el cual contenía 50 ng/µl de DNA genómico, 1X de buffer de reacción (10mM Tris-HCL pH 8.8; 50mM de KCl; 0.08 % Nonidet P40) 2mM de MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP, 0,23µM de cada primer (forward y reverse) y 0.5 unidades de Taq-polimerasa (Fermentas®). La amplificación se efectuó en un termociclador C1000TM BioRad®.

Seis de los microsatélites se trabajaron en sistemas multiplex agrupados en tres dúplex (D) D1 (ILSTS005, ILSTS011), D2 (SPS115, ETH10), D3 (ETH225, INRA064), los cuales fueron agrupados según sus pesos moleculares y temperaturas de hibridación. Las condiciones de amplificación para los marcadores BM1818, BM1824, CSSM31, D1, D2 y D3 fueron de un primer ciclo de 95°C por 5 minutos, seguido de 32 ciclos a 94°C por 40 segundos, a 53.0-64.2°C por 45 segundos y 72°C por 1 minuto, seguido de una extensión a 72°C por 10 minutos. Para los marcadores BM1329, BM6526, INRA006 y MAF65 se utilizó la técnica Touch Down con un primer ciclo de 94°C por 12 minutos, seguido de 10 ciclos de 94°C por 45 segundos, 58.0-61.5°C por 45 segundos y 72°C por 1 minuto, seguido de 20 ciclos a 94°C por 1 minuto, 55.0-60.9°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto,  seguido de una extensión final a 72°C por 10 minutos. Las temperaturas de alineamiento variaron de acuerdo con el tipo de marcador y las condiciones de PCR.

Tabla 1. Secuencia de los marcadores microsatélites, posición cromosómica (Cr), rango alélico y temperaturas de alineamiento (Ta) para la caracterización genética de cabras de Antioquia, Colombia.

Locus

Cr

Secuencia

Cebadores 5' - 3' (F – R)

Rango alélico

Ta

Referencia

BM1329

6

F: TTGTTTAGGCAAGTCCAAAGTC

R: AACACCGCAGCTTCATCC

170-184

61.5 °C

60.9 °C

Martínez et al (2004)

BM1818

23

F: AGCTGGGAATATAACCAAAGG

R: AGTGCTTTCAAGGTCCATGC

241-265

56.0 °C

Serrano et al (2009)

BM1824

-

F: GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC

R: CATTCTCCAACTGCTTCCTTG

169-169

53.0 °C

Yang et al (1999)

BM6526

27

F: CATGCCAAACAATATCCAGC

R: TGAAGGTAGAGAGCAAGCAGC

150-188

60.5 °C

58.0 °C

Martínez et al (2004)

CSSM31

23

F: CCAAGTTTAGTACTTGTAAG

R: GACTCTCTAGCACTTTATCT

129-165

60.0 °C

Serrano et al (2009)

ETH10

5

F: AGGAATATCTGTATCAACCTCAGTC

R: CTGAGCTGGGGTGGGAGCTATAAATA

205-215

56.0 °C

Martínez et al (2004)

ETH225

14

F: GATCACCTTGCCACTATTTCCT

R: ACATGACAGCCAGCTGCTACT

144-156

56.0 °C

Martínez et al (2004)

ILSTS005

10

F: GGAAGCAATGAAATCTATAGCC

R: TGTTCTGTGAGTTTGTAAGC

152-180

64.2 °C

Serrano et al (2009)

ILSTS011

14

F: GCTTGCTACATGGAAAGTGC

R: CTAAAATGCAGAGCCCTACC

266-182

64.2 °C

Serrano et al (2009)

INRA064

-

F: GCCCACAGCGCTCTCTAC

R: CTGAAAGCAGAATGAGGTGC

160-170

56.0 °C

Martínez et al (2004)

MAF065

15

F: AAAGGCCAGAGTATGCAATTAGGAG

R: CCACTCCTCCTGAGAATATAACATG

114-162

58.0 °C

60.0 °C

Martínez et al (2004)

SPS115

-

F: AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG

R: AACGAGTGTCCTAGTTTGGCTGTG

240-250

56.0 °C

Martínez et al (2004)

F=forward, R=reverse y Cr=Cromosoma

La genotipificación se realizó en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6% (19:1 Acrilamida: Bisacrilamida) en una cámara de electroforesis Dual Dedicate Height Nucleic Acid Sequencer (C.B.S Scientific Co), bajo condiciones constantes a 2000 v, 40 mA, 60 w, utilizando buffer de corrida TBE 1X, y teñidos con nitrato de plata por el método de oxidación con ácido nítrico (Budowle et al 1991). La asignación alélica para los diferentes STR´s se estableció según el número de repeticiones variables y por comparación con las escaleras alélicas comerciales GeneRuler™ de 50-1000 bp DNA y GeneRuler™ Ultra Low Range de 25 a 700 pb DNA de Fermentas®. Los resultados fueron confirmados por secuenciación de algunos genotipos para los diferentes marcadores, proceso llevado a cabo por la empresa MACROGEN®, USA.

Se calcularon los parámetros de diversidad genética: Frecuencias alélicas, número de alelos, número efectivo de alelos (Ae), heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He) para cada locus en cada población y se estableció la presencia o ausencia de equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE). Estos análisis se llevaron a cabo utilizando la prueba de Haldane (1954) por medio del programa TFPGA (Wigginton et al 2005). La estructuración genética de la población total y de las subpoblaciones se calculó utilizando los estadísticos F de Wright (Wright 1965) calculado por medio del programa TFPGA (Tools for Population Genetic Analyses) versión 1.3 (Miller 1997). Los análisis de varianza moleculares (Weir y Cockerham 1984) y las matrices de diferenciación entre poblaciones se llevaron a cabo en el programa Arlequin versión 301 (Excoffier et al 2005). 

Se determinó el contenido de información polimórfica (PIC) para cada uno de los marcadores por el método descrito por Botstein et al (1980), con el fin de determinar si los marcadores seleccionados proporcionaban información suficiente para describir la variabilidad genética en la población. También se estimó la probabilidad de exclusión (PE) combinada y para el total de los marcadores, usando la fórmula de Jamieson y Taylor (1997), el cual fue calculado por medio del programa GenAlex, versión 6.4 (Peakall et al 2006). 

Resultados y discusión

Del total de los 13 microsatélites estudiados, uno fue monomórfico (BM1824, con 169 pb), este resultado fue similar a lo encontrado por Acosta et al (2005). Los otros microsatélites presentaron un promedio de 11.7 y 5.23 alelos observados y efectivos, respectivamente. Los microsatélites más polimórficos fueron el BM6526 y el MAF65, los cuales presentaron 20 alelos observados y Ae de 11.5 y 10.1, respectivamente (Tabla 2). Estos resultados fueron similares a los obtenidos por Traoré et al (2008) quienes encontraron 19 alelos para el BM6526, en la caracterización de cabras pertenecientes a poblaciones de Burkina Faso, África. Martínez et al (2004) encontraron 9 alelos para el mismo marcador. Con los resultados encontrados en este estudio, se puede observar una amplia variabilidad genética en la población muestreada de cabras antioqueñas.

Los marcadores menos polimórficos fueron ETH225 y SPS115, los cuales presentaron 5 alelos cada uno, con Ae de 1.42 y 2.12, respectivamente. Esto lo confirmaron Martínez et al (2004), quienes caracterizaron a las cabras blancas andaluzas y en las cuales se encontraron 4 y 5 alelos, respectivamente. La frecuencia más alta (0.83) se observó para el alelo 150 en el marcador ETH225, seguido del marcador ILSTS011 con 0.61 para el alelo 268, mientras que las frecuencias más bajas (<0.01) fueron para los alelos 152, 156 y 215 de los marcadores ILSTS005, ETH10 y ETH225, respectivamente. Para ocho de los STR evaluados se observó que la Ho fue similar a la He y los marcadores ILSTS011, INRA064, MAF65 y SPS115 no se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg (p<0.05).

Altos valores de He y Ho (0.53 a 0.95) se observaron en 11 microsatélites (excepto para ETH225). El índice del contenido de información polimórfica (PIC) fue superior a 0.50 (0.67 a 0.91) en ocho marcadores, con Ae entre 3.33 y 11,5, por lo tanto, es posible utilizarlos en posteriores análisis de parentesco. El marcador ETH225 fue el menos informativo (PIC=0.22) y los marcadores ETH10, INRA064 y SPS115 obtuvieron valores de PIC de 0.47, 0.42 y 0.42 y de Ae de 2.23, 2.24 y 2.12, respectivamente. En la Tabla 2 se aprecia que la población de cabras de Antioquia tiene una alta variabilidad genética y que el panel básico de marcadores estudiados (media de He=0.71, Ho=0.68, y PIC=0,67) es informativo y adecuado (Botstein et al 1980; Bowcock et al 1994). El panel de marcadores presentó una probabilidad de exclusión (PE) individual menor de 0.30 en los marcadores ETH225, SPS115, INRA064 y ETH10 y valores entre 0.49 a 0.82 en los marcadores ILSTS005, BM1329, ILSTS011,BM1818, CSSM31, INRA006, MAF065 y BM6526. Para el total de microsatélites la probabilidad de exclusión fue superior al 99.99%, lo cual confirma el poder de exclusión y de análisis de los marcadores con respecto a su número de alelos efectivos y a las frecuencias alélicas de los mismos. En la Tabla 3 se presenta el análisis de PE acumulada, con los marcadores ordenados alfabéticamente y se aprecia que con los seis primeros marcadores (BM1329, BM1818, BM6526, CSSM31 y ETH10) se obtuvo un PE acumulado de 0.99, indicando que se puede realizar una prueba de paternidad o filiación confiable con al menos seis de los marcadores. 

Los valores de estructura poblacional (FST) fueron cercanos a cero, variando entre 0.01 (ILSTS005) a 0.1 (SPS115), con promedio de 0.04, indicando ausencia de estructura genética para la población caprina de Antioquia. Los valores de FIS variaron de -0.28 (INRA064) a 0.24 (ILSR011) y de FIT, para 10 marcadores, varió de -0.05 a 0.09 y dos marcadores con valores de 0.23 y 0.28 (INRA064 y ILSTS011), indicando que no hay fijación de alelos (Hartl y Clarck 1997; Weir y Cockerham 1984), debido posiblemente al intercambio de reproductores entre apriscos y la mezcla de razas, lo que evidencia la falta de estructura genética de los apriscos. 

Los resultados obtenidos con los marcadores microsatélites evaluados mostraron poca diferencia entre las subpoblaciones con respecto al número de diferencias pareadas entre los haplotipos de cada subpoblación (p>0.05) y muestra una posible similitud ancestral y molecular entre los individuos que a su vez tienen alta variabilidad pero que no diverge entre núcleos, subpoblaciones o grupos de áreas agroecológicas especificas. 

Tabla 2. Frecuencias alélicas, pesos moleculares (valores entre paréntesis), heterocigosis, contenido de información polimórfica (PIC), índices FIS, FIT y FST, y número efectivo de alelos (Ae) para los microsatélites analizados en la población caprina de Antioquia.

Alelo

SPS

115

ETH

225

ETH

10

INRA

064

BM

1329

ILSTS

011

ILSTS

005

INRA

006

BM

1818

CSSM

31

MAF

65

BM

6526

1

0.01

(240)

0.01

(144)

<0.01

(205)

<0.01

(160)

0.04

(170)

<0.01

(266)

<0.01

(152)

0.03

(103)

<0.01

(241)

<0.01

(129)

0.01

(114)

<0.01

(150)

2

0.09

(242)

0.07

(148)

0.01

(207)

<0.01

(162)

0.38

(172)

0.06

(268)

<0.01

(158)

0.05

(107)

0.01

(243)

<0.01

(131)

0.02

(116)

0.01

(152)

3

0.43

(246)

0.83

(150)

0.34

(209)

0.03

(164)

0.08

(174)

0.09

(270)

<0.01

(160)

0.02

(109)

0.01

(245)

0.02

(133)

0.03

(118)

0.04

(154)

4

0.53

(248)

0.09

(152)

0.57

(211)

0.47

(166)

0.06

(176)

0.06

(272)

0.01

(166)

0.19

(111)

<0.01

(247)

0.02

(135)

0.06

(120)

0.06

(156)

5

0.02

(250)

<0.01

(156)

0.08

(213)

0.48

(168)

0.19

(178)

0.08

(274)

0.01

(168)

0.03

(115)

0.01

(249)

0.03

(137)

0.1

(122)

0.1

(158)

6

 

 

<0.01

(215)

0.02

(170)

0.15

(180)

0.27

(276)

0.18

(170)

0.11

(119)

0.05

(251)

0.02

(139)

0.09

(124)

0.15

(160)

7

 

 

 

 

0.03

(182)

0.35

(278)

0.13

(172)

0.14

(121)

0.19

(253)

0.04

(141)

0.05

(126)

0.1

(162)

8

 

 

 

 

0.05

(184)

0.08

(280)

0.06

(174)

0.11

(123)

0.35

(255)

0.15

(143)

0.08

(128)

0.08

(164)

9

 

 

 

 

 

<0.01

(282)

0.49

(176)

0.11

(125)

0.13

(257)

0.22

(145)

0.06

(130)

0.13

(166)

10

 

 

 

 

 

 

0.1

(178)

0.14

(127)

0.15

(259)

0.18

(147)

0.13

(132)

0.06

(168)

11

 

 

 

 

 

 

0.02

(180)

0.06

(129)

0.05

(261)

0.13

(149)

0.16

(134)

0.05

(170)

12

 

 

 

 

 

 

 

0.02

(131)

0.06

(263)

0.05

(151)

0.13

(136)

0.02

(172)

13

 

 

 

 

 

 

 

 

<0.01

(265)

0.02

(153)

0.04

(138)

0.01

(174)

14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.03

(155)

<0.01

(140)

0.02

(176)

15

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.02

(157)

<0.01

(148)

0.03

(178)

16

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.02

(159)

0.02

(150)

0.08

(180)

17

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.02

(161)

<0.01

(152)

0.04

(182)

18

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.01

(163)

<0.01

(154)

0.02

(184)

19

 

 

 

 

 

 

 

 

 

0.01

(165)

<0.01

(158)

0.01

(186)

20

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

<0.01

(162)

<0.01

(188)

N

112

562

545

432

576

491

533

32

558

169

245

367

He

0.90

0.29

0.55

0.55

0.78

0.70

0.78

0.89

0.79

0.87

0.53

0.91

Ho

0.95

0.29

0.52

0.68

0.75

0.51

0.72

0.84

0.73

0.83

0.42

0.88

EHW

No

Si

Si

No

Si

No

Si

Si

Si

Si

No

Si

PIC

0.42

0.28

0.47

0.42

0.75

0.75

0.67

0.89

0.77

0.86

0.89

0.91

PE

0.14

0.05

0.15

0.15

0.41

0.31

0.41

0.61

0.43

0.59

0.67

0.7

FIT

0.03

0.02

0.06

0.23

0.04

0.28

0.09

0.07

0.08

0.05

-0.05

0.04

FST

0.1

0.04

0.03

0.04

0.02

0.05

0.01

0.09

0.02

0.05

0.03

0.03

FIS

0.14

-0.02

0.03

-0.28

0.01

0.24

0.08

-0.02

0.06

0

-0.08

0.01

Ae

2.12

1.42

2.23

2.24

4.52

4.52

3.33

8.39

4.88

7.57

10.07

11.46

N=Número de individuos, He=Heterocigosis esperada, Ho=Heterocigosis observada, EHW=Equilibrio Hardy-Weinberg (si p>0.05), PE=probabilidad de exclusión, FIT= Desvío de en el total de la población, FIS= Desvío medio del EHW en las subpoblaciones, FST=Índice de fijación de Wright

 

Tabla 3. Probabilidad de Exclusión (PE) individual y acumulada para los marcadores microsatélites (STR) en la población caprina de Antioquia

STR

Individual

Acumulada

BM1329

0.59

0.59

BM1818

0.61

0.84

BM6526

0.82

0.97

CSSM31

0.74

0.99

ETH10

0.27

0.99

ETH225

0.16

1

ILSTS011

0.59

1

ILSTS005

0.49

1

INRA006

0.76

1

INRA064

0.26

1

MAF065

0.80

1

SPS115

0.23

1

Conclusiones

Agradecimientos 

Este artículo es una investigación derivada del macro-proyecto “Consolidación del sistema de registro genealógico y de control lechero en cabras en Antioquia, para evaluación genética y montaje de programas de mejoras genéticas” financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, la Universidad de Antioquia y la Asociación Colombiana de Caprinoovinocultores de Antioquia y otros productores no asociados. Los autores agradecen a los diferentes caprinocultores por permitirnos realizar este estudio en sus apriscos y a los estudiantes de pregrado de Zootecnia y Biología y a los jóvenes investigadores del grupo GaMMA de la Universidad de Antioquia por su colaboración. 

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Received 19 November 2011; Accepted 15 March 2012; Published 7 May 2012

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