Microorganismos y micronutrientes en el crecimiento y desarrollo del Aliso (Alnus acuminata H.B.K.) en un sistema silvopastoril alto andino

M Molina, M Medina* y L Mahecha*

Secretaría de Agricultura y Desarrollo Rural de Antioquia, Colombia
* Universidad de Antioquia, Grupo GRICA, Facultad de Ciencias Agrarias, AA. 1226, Medellín
maumolina243@yahoo.es  ;   solmedina@agronica.udea.edu.co

Resumen

Se aislaron microorganismos rizosféricos de un rodal de aliso (Alnus acuminata H.B.K.) del municipio de Jardín (Antioquia) pertenecientes al género Frankia de actinomicetos y al género Glomus de hongos micorrizógenos arbusculares (HMA).  La cepa de Frankia se codificó como UdeA905 y la cepa de HMA como UdeA1907, las cuales se multiplicaron en sustratos estériles para su posterior aplicación en condición de campo.

Se estableció un sistema silvopastoril con aliso (Alnus acuminata H.B.K.) bajo un arreglo 5x10 metros en una pastura compuesta por 80% kikuyo (Pennisetum clandestinum Host), 15% pasto brachiaria (Brachiaria decumbens) y 5% yaraguá peluda (Melinis minutiflora), de acuerdo a una estimación realizada por el método de composición botánica de números individuales.  Se realizó control manual de malezas y una fertilización basal de acuerdo al análisis de suelos.  Los tratamientos que se evaluaron correspondieron a la inoculación con las cepas reportadas de Frankia spp. (UdeA905) y de HMA (UdeA1907), las cepas reconocidas CUNMS502 y MICUNMS32 de Frankia spp y HMA respectivamente, y a las interacciones de éstas con los microelementos boro (B), cobalto (Co) y molibdeno (Mo); conformando 32 tratamientos en diseño factorial.  Las dosis empleadas para cada factor estuvieron de acuerdo a los requerimientos de la especie y al análisis del suelo.

Para la evaluación se empleó un diseño de clasificación experimental en arreglo factorial simétrico 2⁵ parcialmente confundido de índole balanceado efecto fijo, con análisis ANOVA, donde se evaluaron las variables altura de la planta, diámetro basal, contenido foliar de nitrógeno y fósforo y producción de esporas de HMA en el suelo.  La aplicación de Co mostró un efecto positivo en la altura, lo cual se manifestó en la tasa de crecimiento, a pesar de que mostró un efecto antagónico con la concentración foliar de fósforo; mientras que el B presentó un efecto positivo para la variable diámetro y el Mo en la concentración foliar de nitrógeno.  Las cepas reconocidas CUNMS502 y MICUNMS32 presentaron un efecto significativo (P<0.05) en la tasa de crecimiento con respecto a los demás factores evaluados. El análisis descriptivo permitió establecer que el tratamiento con todos los factores presentó el mejor resultado en la tasa de crecimiento del aliso con respecto a la mayoría de los tratamientos en donde se utiliza cada factor en forma individual.

Palabras clave: fertilización, Frankia spp., ganadería, hongos micorrizógenos, sostenibilidad, suelo, trópico alto

Microorganisms and micronutrients in the growth and development of Alder (Alnus acuminata H.B.K.) in high Andean silvo-pastoral systems

Abstract

Rizospheric microorganisms were isolated from a forest of Alder (Alnus acuminata H.B.K.) in the municipality of Jardin (Antioquia) belonging to the genus Frankia of actinomycetes and to the genus Glomus of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF).  The strain of Frankia was codified as UdeA905 and the strain of AMF was codified as UdeA1907, which were multiplied in sterile substrates for their later application in the field.

A silvo-pastoral system with alder (Alnus acuminata H.B.K.) was established under an arrangement 5x10m in a pasture composed of 80% of kikuyu grass (Pennisetum clandestinum Host), 15% of Brachiaria grass (Brachiaria decumbens) and 5% of yaragua grass (Melinis minutiflora) according to an estimation realized by the method of botanical composition of individual numbers.  Manual control of weeds was made and a basal fertilization according to the soil analysis. The treatments that were evaluated corresponded to the inoculation with the strains already reported of Frankia spp. (UdeA905) and the AMF (UdeA1907), the recognized strains CUNMS5O2 and MICUNMS32 of Frankia spp. and AMF respectively, and to the interactions of these with the microelements boron (B), cobalt (Co), molybdenum (Mo); conforming 32 treatments in a factorial design. The doses used for each factor were according to the requirements of the species and to analysis of the soil.

For the evaluation a design of experimental classification in symmetrical factorial 2⁵ partially confounded was used with a balanced fixed effect and ANOVA analysis.  The variables considered were height of the plant, basal diameter, foliar content of nitrogen and phosphorus and production of spores of AMF in the soil.  The application of Co showed a positive effect on the height, which was observed in the growth rate of the alder, although it showed an antagonistic effect on the concentration of foliar phosphorus. Whereas the B presented a positive effect for the diameter and the Mo presented a positive effect in the concentration of foliar nitrogen. Recognized strains CUNMS502 and MCUNMS32 had a significant effect (P<0.05) on the growth rate with respect to the other evaluated factors. 

The descriptive analysis allowed establishing that the treatment with all the factors presented the best result in the growth rate of alder with respect to the most of the treatments in which each factor was used individually.

Key words: Cattle, fertilization, Frankia spp., high tropic, mycorrhizal fungi, soil, sustainability

Introducción

Entre las principales causas atribuibles a la baja productividad y pérdida de la biodiversidad de los sistemas de producción bovina en el trópico alto se encuentra la incorporación de praderas de gramíneas dirigidas a la cría de bovinos, en suelos que se caracterizan por tener un pH bajo, alto contenido de aluminio y manganeso, alta capacidad de retención de fósforo y que presentan generalmente bajo nivel de micronutrientes como zinc (Zn), azufre (S), calcio (Ca), molibdeno (Mo), cobalto (Co) y boro (B) entre otros; generándose pasturas degradadas y poco productivas, estas condiciones hacen ineficientes los actuales sistemas y afectan negativamente el medio ambiente (Mateus 2003; Murgueitio 1999). (Figura 1)

La problemática expuesta indica que se requiere establecer sistemas de producción, sostenibles y adaptables a nuestras regiones, donde los sistemas silvopastoriles, representan una alternativa viable para la ganadería bovina (Murgueitio y Molina 2001). No obstante, su adopción e implementación por parte de los productores aún es muy lenta, relacionándose en gran parte, con los largos períodos de tiempo que el productor debe esperar sin utilizar los potreros luego del transplante de los árboles y arbustos, entre 12 y 18 meses como mínimo, según la especie y el uso al que se destinará como ramoneo, sombra, maderable, otros; si se introducen antes los animales en el sistema, cuando aún los árboles no están debidamente anclados y no han alcanzado la vigorosidad y la altura que disminuyen el riesgo de daño por parte de los animales, su sobrevivencia se verá comprometida y con esto, el éxito del sistema.

La situación es aún más crítica en sistemas ganaderos de trópico alto, debido a que el tamaño de los predios es pequeño, dificultándose la destinación de áreas para establecimiento de árboles, con su respectivo aislamiento por largos períodos de tiempo mientras los árboles crecen. En estas zonas, ubicadas a más de 1800msnm, la luminosidad disminuye (Sadanandan y Brown 1997), el crecimiento de los árboles es menor comparado con los árboles que se establecen en zonas de trópico medio y bajo, y por lo tanto, se retarda aún más el uso de los sistemas silvopastoriles. En general para trópico alto existen pocas especies conocidas para la reforestación y/o sistemas silvopastoriles, además presentan un crecimiento lento y se desconocen en muchos casos datos completamente relacionados con aspectos como propagación, crecimiento y desarrollo, exigencias nutricionales, necesidades hídricas, rendimiento, capacidad de utilización e interacción con microorganismos del suelo (Ruiz 1985).

El aliso (Alnus acuminata H.B.K.) es una especie forestal con potencial para contribuir el abastecimiento de la demanda de especies arbóreas en trópico alto andino, que se emplea para la obtención de madera, leña y de protección del suelo y reciclaje de nutrientes. Se desarrolla adecuadamente en zonas de precipitación media anual entre 2000 y 3000mm, temperaturas que oscilan entre 17 y 7⁰C y con presencia de nubes o neblina que dan como resultado humedad relativa alta y evaporación baja. Esta especie es exigente en humedad y luz, el crecimiento es rápido y puede alcanzar alturas de 25-35m y diámetros entre 45-75cm a la altura del pecho, con rendimientos promedios de 10 a 15m³/ha/año (Restrepo 2002; Ruiz 1985). En cuanto a sus requerimientos nutricionales, la deficiencia de Nitrógeno (N) y fósforo (P) reduce significativamente el crecimiento, el potasio limita el crecimiento en altura y por ser una especie fijadora de N para el desarrollo nodular y fijación requiere de micronutrientes como Co, Cu, Fe, B, Mo y Ni; sin embargo, su funcionamiento y aplicación han sido poco estudiados (Ganio et al 2002; Escobar et al 1983; Russell et al 1968).

Así mismo, se caracteriza por presentar una asociación simbiótica a nivel de raíz con el actinomiceto Frankia spp., lo cual hace que se constituya en una especie propicia para la restauración de suelos degradados por actividad minera y en la aplicación de sistemas silvopastoriles para el control de la degradación de los suelos por agricultura y ganadería semiextensiva de ladera y contribuye con el reciclaje de nutrientes (Bonilla et al 2003; Novoa et al 2002; Ruiz 1985).  El aliso forma simbiosis con hongos micorrizógenos como los hongos micorrizógenos arbusculares (HMA), para la obtención de fósforo y otros nutrientes, y puede beneficiar el proceso de fijación de nitrógeno por parte del actinomiceto Frankia spp., formando una asociación tripartita con el aliso (Corredor 2003; Infante 2003; Raddattz 2002; Velasco y Zambrano 2000; Barrera et al 1999; Marschner y Dell 1994; Pate 1994). Además, se estimula un ambiente más competitivo para los patógenos (Bosirov et al 2002; Cárdenas 2000; Russo 1990; Zavitkovski and Newton 1968).

Como componente dentro del sistema silvopastoril, el aliso (Alnus acuminata H.B.K) se asocia fácilmente con otras especies como el arboloco (Montonoa ovalifolia), roble (Quercus humboldti), siete cueros (Tibouchina lepidota), acacia japonesa (Acacia decurrens), pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum), pasto falsa poa (Holcus lanatus) (Restrepo 2002; Giraldo 2000; García 1990;  Ibrahim et al 1999; Ruiz 1985).

Builes et al (2004) estudiaron el efecto de la arborización con aliso (Alnus acuminata H.B.K) sobre la producción y calidad de pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum) encontrando una producción de pasto por corte de 5410kg de materia fresca/ha, con un nivel de proteína cruda del 20.7% y una tasa de degradación de 0.0182% por hora, mostrando que mejora la calidad nutricional del pasto pasto frente a lo reportado por Laredo (1985).  Por otro lado Ruiz (1985) encontró en un silvopastoril con kikuyo un mejor crecimiento del pasto, debido a la alta fijación de N ejercida por el aliso en simbiosis con Frankia spp.

Con base en lo anterior, en este trabajo, se estudió el efecto de la inoculación con microorganismos rizósfericos y la aplicación de algunos micronutrientes en el crecimiento y desarrollo del aliso (Alnus acuminata H.B.K)eon microorganismos rizulaci e la respuesta de la especie os o en un sistema silvopastoril alto andino, con el fin de contribuir al conocimiento de una especie promisoria en la implementación de estos sistemas en el trópico alto.

Materiales y métodos 

Cepas de microorganismos empleados 

El aislamiento de microorganismos rizosféricos adaptados a la zona, se realizó a partir de árboles élite de aliso (Alnus acuminata H.B.K.), ubicados en la Finca El Placer Vereda El Cuchillón Jardín (Antioquia) (Molina et al 2006) . La cepa de Frankia spp. que se obtuvo se codificó como UdeA905. Para su empleo en la etapa de vivero, ésta se multiplicó en medio caseína con agitación a 40rpm y temperatura controlada de 35ºC, obteniéndose un inoculante con una concentración de 1 x 10⁸ UFC.

La cepa aislada de HMA perteneciente al género Glomus (Molina et al 2006), se codificó como UdeA1907 y se multiplicó en suelo proveniente del rodal de aliso desinfectado con Bazamid (3,5-dimetil-(2H)-tetrahidro-1,3,5-tiadazina-2-tiona al 98%) en concentración 0.05%, cuarzo y cisco de arroz en proporción 2:1:1.

Se emplearon las cepas CUNMS502 de Frankia spp. y MICUNMS32 de HMA obtenidas por la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín y evaluadas previamente en aliso en el municipio de Rionegro (Antioquia) (Orozco et al 2005).

Tratamientos

El trabajo de campo se realizó durante el segundo semestre de 2005. Los tratamientos que se evaluaron en la especie aliso correspondieron a la inoculación con las cepas ya descritas y su interrelación con los microelementos boro (B), cobalto (Co) y molibdeno (Mo); conformando 32 tratamientos en diseño factorial. Las dosis empleadas para cada factor estuvieron de acuerdo a los requerimientos de la especie y el análisis del suelo (Tabla 1).

 Variables

Las variables consideradas fueron altura, diámetro y tasa de crecimiento de los árboles, concentración de N y P foliar, y número de esporas en el suelo. La altura de las plantas se midió durante cuatro períodos: 4 semanas (período 1), 8 semanas (período 2), 12 semanas (período 3) y 16 semanas (período 4). Las mediciones fueron realizadas desde la base del tallo hasta el meristemo apical de los árboles. El diámetro fue medido a una altura de 10 cm desde la base del tallo, esta medición fue realizada con un centímetro (en mm). En la determinación de la tasa de crecimiento se estimó el volumen de los árboles de aliso mediante la ecuación derivada por Del Valle y González (1987) y confirmada por Betancur (1989) para esta especie con un alto coeficiente de regresión (0.97)

Vcc = 0.02102 + 0.000036338 (d²) H

El diámetro y la tasa de crecimiento igual que la altura, fueron medidas en los 4 períodos.

La concentración de N y P foliar, fueron determinadas en el laboratorio, mediante el método de Kjeldahl y espectofotometría, respectivamente. El número de esporas, fue determinado por el método de tamizaje y conteo en estereoscopio. El N, P, y el número de esporas, se midió tomando una muestra de cada tratamiento en cada una de las 4 repeticiones, para un total de 128 muestras; estas variables sólo fueron medidas en el período 4.

Diseño experimental

Se empleó un diseño de clasificación experimental en arreglo factorial simétrico 2⁵ parcialmente confundido en los efectos (1/4 MoCoBNU; 1/4 CoBNU, 1/4 MBNU; 1/4 MoBNU) en bloques aleatorizados con medidas repetidas de índole balanceado efecto fijo, con las variables altura inicial de la plántula y diámetro del tallo, mediante análisis ANOVA y validación de supuestos; empleándose contraste canónico ortogonal de índole multidimensional y análisis exploratorio descriptivo unidimensional a fin de establecer variabilidad y efecto promedio y control de calidad estadístico. Se realizaron cuatro mediciones en el tiempo constituyendo un ANOVA de medidas repetidas.

En la parcela principal se emplearon cuatro replicaciones en ocho bloques cada una con treinta y dos tratamientos donde cada tratamiento estuvo conformado por seis árboles a una distancia de 5m entre plantas y 10m entre surcos donde se dejaron dos árboles de los extremos en cada tratamiento como efecto de borde.

Modelo estadístico

El modelo estadístico del trabajo de acuerdo al diseño parcialmente confundido fue el siguiente (Figura 2): 

Montaje del ensayo en condiciones de campo

Se realizó una multiplicación masiva, aproximadamente 5000 plántulas en el vivero municipal de Jardín-Antioquia ubicado a una altura de 1900msnm y temperatura promedio entre 12 y 15ºC, se emplearon semillas de aliso (Alnus acuminata H.B.K.) certificadas y desinfectadas con etanol al 70% e hipoclorito al 1%. Se utilizó como sustrato cuarzo: vermiculita: caolinita en proporción 1:1:1 desinfectado con bazamid (0.05%), las plántulas permanecieron en etapa de vivero por 24 semanas. Posteriormente se pasaron a bolsas de 10 x 3cm. De las plántulas obtenidas se seleccionaron 768 árboles para garantizar homogeneidad en el tamaño y evitar la covarianza en el análisis estadístico. Las plántulas estuvieron en vivero hasta que alcanzaron una altura en promedio de 8cm. Para la aplicación de los tratamientos, se empleó 1g de inoculante que contenía 60 esporas en promedio para cada uno de los tratamientos de las cepas de HMA. Los tratamientos con las cepas de Frankia spp. se realizaron mediante la aplicación de un mililitro de suspensión bacterial con concentración de 1 x 10⁸ UFC por plántula. A las cuatro semanas se realizó el transplante a campo.

La aplicación de los microelementos se realizó al momento del transplante de acuerdo a cada tratamiento teniendo en cuenta el análisis de suelos (Molina et al 2006), se empleó ácido bórico (H₃BO₃), cloruro de cobalto (CoCl₂.6H₂O) y molibdato de sodio (Na₂MoO₂.2H₂O) como fuentes de B, Co y Mo en dosis de 0.46, 0.01 y 0.2mg/kg respectivamente.

El establecimiento del sistema silvopastoril se realizó en el municipio de Jardín, zona de vida Bosque Muy Húmedo Montano Bajo (bmh-MB) con precipitaciones entre 2000 y 4000mm por año y temperaturas de 12 a 18°C, en la denominada zona marginal cafetera a una altura de 2000msnm, los suelos corresponden al orden inceptisol suborden andept y subgrupo typic dystrandept pertenecientes a la asociación Jericó y Unidad Chinchiná, los cuales están conformados por cenizas volcánicas de materiales sólidos de tamaño variable. Dichas cenizas se han meteorizado dando lugar a suelos de gran productividad que poseen buenas propiedades físicas, retención de humedad y resistencia a la erosión con prácticas adecuadas de manejo de suelos (Comité Departamental de Cafeteros de Antioquia 1992; Holdridge 1982).

El lote empleado tiene una extensión de cuatro hectáreas conformada en un 80% pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum Host), 15% pasto brachiaria (Brachiaria decumbens) y 5% yaraguá peluda (Melinis minutiflora), de acuerdo a una estimación realizado por el método de composición botánica de números individuales (Giraldo 1994). Los árboles de aliso se sembraron a distancia de 5x10 metros de acuerdo a la aleaterización de los tratamientos, se realizó control manual de malezas y una fertilización basal de acuerdo al análisis de suelos (Tabla 2, Figura 3).

Resultados y discusión

Altura

Al comparar el efecto de los tratamientos que incluyen cada factor de forma individual (microorganismos adaptados a la zona -UDEA905 y UdeA1907 (N)-, microorganismos reconocidos -CUNMS502 de Frankia spp. y MICUNMS 32 (U)-, Co, Mo, B), sobre la altura de los árboles de aliso, en todos los períodos, se encontró que ningún factor fue diferente significativamente con respecto a los otros (P<0.05) (Tabla 3).

A las 4 semanas de transplantados los árboles a campo (Período 1), se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: NxU y BxNxU (Tabla 4).

Cuando se comparó el promedio de los tratamientos que incluían un factor específico con la no aplicación del mismo (Ej todos los tratamientos que incluían B vs todos los tratamientos que no lo incluían), sólo se encontró efecto significativo positivo en la altura de los árboles, con la aplicación de los microorganismos U (P<0.05). (Tabla 5).

Para el periodo dos (8 semanas después del transplante), se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: COxN, NxU, BxCOxN, BxNxU, COxMOxN, COxNxU (Tabla 4).  Al igual que en el período 1, el único factor que mostró un efecto significativo positivo en la altura de los árboles, con respecto a su no aplicación, fue la aplicación de las cepas U (P<0.05) (Tabla5).   

Con respecto al periodo tres (12 semanas después del transplante), se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: BxMO, BxN, MOxU, NxU, BxCOxN (Tabla 4). En este período, además de la aplicación de cepas U, el B también mostró un efecto significativo positivo en la altura de los árboles, con respecto a su no aplicación (Tabla 5).

En el último periodo se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: BxN, NxU, BxNxU, BxCOxN (Tabla 4). Al igual que en el período tres, la aplicación de las cepas U y la aplicación de B, fueron los únicos factores que mostraron efecto significativo en la altura de los árboles, respecto a su no aplicación. (Tabla 5).

De acuerdo a los resultados presentados, se encontró un efecto favorable de la aplicación de las cepas U sobre la altura. El promedio general de altura para 120 días después del transplante, considerando todos los tratamientos evaluados, fue de 38.47cm, mientras que el promedio de todos los tratamientos que incluían el factor U fue de 39.71, lo que muestra que la aplicación de únicamente las cepas U incrementa la altura significativamente.

En la Figura 7 se observa el comportamiento de los diferentes factores a través de los diferentes periodos. La diferencias entre las cepas U y las adaptadas a la zona, podría estar relacionado con la efectividad de las cepas U frente a las cepas adaptadas ecológicamente a la región, las cuales a pesar de tener un mayor número en la población y presencia en la región, no tienen la misma efectividad. Sánchez (1998) en otra especie arbórea chachafruto (Erytrina edulis), encontró una situación similar a lo encontrado en este trabajo con respecto a la interrelación de la aplicación de inóculos específicos de micorrizas y cepas “nativas” para la altura de la especies estudiadas.

En la Figura 4, también se observa un repunte de la aplicación de Co, a partir del tercer periodo, obteniéndose una altura de 36.58cm en campo a los 120 días; esto podría ser atribuido a que el Co es un componente esencial del metabolismo de microorganismos como constituyente de la vitamina B12, en especial aumentando la capacidad de fijación de nitrógeno por parte del actinomiceto Frankia spp. y el aumento de la altura en el Aliso cuando se asociaron Co con la inoculación del actinomiceto, como ha sido demostrado por otros investigadores (Ganio et al 2002; Russell et al 1968)

Aunque la Figura4 muestra la aplicación individual de Co sin mezclar con microorganismos, los resultados podrían ser atribuidos a la presencia natural de microorganismos micorrizógenos (HMA) en el suelo, encontrados durante la medición de la variable número de esporas, como se expondrá más adelante. El resultado en altura de este trabajo fue superior a lo hallado por Russell et al (1968) en Aliso (Alnus glutinosa), en donde encontró a los 144 días de la siembra con presencia de Co, una altura de 31.5cm. 

La altura de los árboles con la inclusión de todos los factores (NxUxCoxBxMo) comparada con la adición de cada factor de forma individual, fue mayor a las 4 semanas respecto a la adición de B o Mo, tratamientos con los que en forma individual se encontraron las menores alturas de los árboles, pero fue menor que con la aplicación tanto de los microorganismos adaptados (N) como reconocidos (U); sin embargo, no hubo diferencias significativas en ninguno de los casos. A las 8 semanas, solo fue superior significativamente a la adición de B. A las 12 semanas solo fue superior significativamente a la adición de Mo.

La mayor altura de los árboles en el período 1 se obtuvo con el tratamiento que incluía los dos tipos de microorganismos más Co (CoxNxU), siendo significativamente superior a la aplicación de solo Mo, solo B y a la combinación Bx CoxMo. Esto muestra que el Co es un micronutriente de gran importancia en el crecimiento de las plantas de aliso, y que interactúa efectivamente en combinación con los microorganismos adaptados y reconocidos, pero no con el Mo y el B. Respecto al Mo, podría pensarse en niveles de tolerancia bajos para las plantas de aliso, debido a que en análisis de suelo realizado por Molina et al (2005), en esta investigación, se encontraron altos niveles de molibdeno (11.4mg/kg), lo cual pudo incidir en estos resultados.

En los demás períodos, la mayor altura se obtuvo con la aplicación de todos los factores (BxCoxMoxNxU). (Figura 5a)

De los resultados expuestos, se infiere que la altura en campo tuvo una fase inicial lenta hasta las 12 semanas después del transplante, a partir de donde se observa un aumento considerable en este parámetro. (Figura 8) 

Diámetro

Debido a que el diámetro es una variable necesaria para la determinación de la tasa de crecimiento, se limitará la discusión a los eventos más evidentes.

Al comparar el efecto de los tratamientos que incluyen cada factor de forma individual, sobre el diámetro de los árboles de aliso, en todos los períodos, se encontró que ningún factor fue diferente significativamente con respecto a los otros (P<0.05) (Tabla 6).

En el período 1, se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: NxU, CoxN, BxCoxN, BxNxU, CoxMoxU, CoxMoxN (Tabla 7).

Cuando se comparó el promedio de los tratamientos que incluían un factor específico con la no aplicación del mismo, sólo se encontró efecto significativo positivo en el diámetro de los árboles, con la aplicación de los microorganismos U (P<0.05). (Tabla 8).

Para el periodo dos, se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: COxN, BxN, CoxN, NxU, CoxNxU (Tabla 7). Igual que en el período 1, el único factor que mostró un efecto significativo positivo en al diámetro de los árboles, con respecto a su no aplicación, fue la aplicación de las cepas U (P<0.05). (Tabla 8). Con respecto al periodo tres (12 semanas después del transplante), se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: Bx Mo, BxN, BxU y NxU (Tabla 7). En este período la aplicación de cepas U mostró un efecto significativo positivo en el diámetro de los árboles, con respecto a su no aplicación (Tabla 8).

En el último periodo se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: BxMo, BxN, NxU, CoxNxU, BxCoxN (Tabla 7). A diferencia del período tres, la aplicación de las cepas U y la aplicación de B, fueron los únicos factores que mostraron efecto significativo en el diámetro de los árboles, respecto a su no aplicación. (Tabla 8). El efecto del B mostrado en el diámetro en este período, se relaciona de alguna forma, con el estudio realizado por Bolaños et al (2002) donde en plantas de Discaria trinervis (Familia Rhamnaceae) fueron inoculadas con Frankia BCU110501 que habían sido cultivadas previamente sin B (-B) o con B+ y sin (-nitrógeno) o con amonio (+nitrógeno) como fuente del nitrógeno. Dos meses después de la inoculación, el índice más alto de la colonización fue obtenido en las plantas con B e inoculadas con Frankia spp., las tasas de nodulación fueron reducidas en plantas deficientes de B. Estos autores, también encontraron que la fluorescencia de los cultivos positivos a naranja de acridina indicaron que la deficiencia de B provocó cambios en las células. Estos resultados demuestran el requisito del B no solamente para establecer una relación simbiótica Discaria con Frankia BCU110501, sino también que el microelemento es necesario para la capacidad vegetativa del crecimiento y de la colonización de Frankia spp.; además el B es esencial cuando las bacterias se cultivan bajo limitación del nitrógeno (Bolaños et al 2000). En esta investigación los autores concluyeron que la ausencia de B disminuye la estabilidad de la pared celular al no poder generarse los enlaces ester entre el borato y los grupos cis-diol de las moléculas constitutivas de la pared celular, lo que determina, un papel estructural para el B. Lo anterior podría indicar la acción significativa del B en el desarrollo del diámetro en este trabajo. 

En resumen, el mejor efecto de la variable diámetro se obtuvo con los factores de las cepas U (5.89) y B (5.88) respecto a los factores individuales de Mo, Co o de cepas N; lo que se manifiesta cuando el análisis se hace de manera individual (Tabla 8, Figura 6). Además, en las Figura 5b se muestra el crecimiento del diámetro y el desarrollo de la nodulación en el aliso.

Tasa de crecimiento

Al comparar el efecto de los tratamientos que incluyen cada factor de forma individual, sobre la tasa de crecimiento de los árboles de aliso, en todos los períodos, se encontró que el tratamiento que solo contenía adición de las cepas U presentó la mayor altura de los árboles, aunque no fue diferente significativamente con respecto a los otros (Tabla 9).  

En el período 1, se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: NxU, BxMoxU, BxNxU, BxCoxNxU (Tabla10).

Cuando se comparó el promedio de los tratamientos que incluían un factor específico con la no aplicación del mismo, sólo se encontró efecto significativo positivo en la tasa de crecimiento de los árboles, con la aplicación de los microorganismos U (P<0.05). (Tabla 11). 

Para el periodo dos, se encontró interacción significativa en las siguientes combinaciones: BxMo, CoxN, NxU, BxCoxN, CoxMoxN, CoxNxU (Tabla 10). Igual que en el período 1, los factores que mostraron un efecto positivo en su aplicación para el incremento en la tasa de crecimiento, con respecto a su no aplicación, fueron el factor B y las cepas U (P<0.05). (Tabla 11). Con respecto al periodo tres y cuatro no se encontraron diferencias significativas entre tratamientos (Tabla 10). Solo en el período cuarto la aplicación de cepas U mostró un efecto significativo positivo la tasa de crecimiento de los árboles, con respecto a su no aplicación (Tabla 11).

Una posible explicación respecto al efecto de la cepas U fue la mayor capacidad de fijación de nitrógeno lo que estaría indicando que bajo estas condiciones el nitrógeno podría ser deficiente y el B que es requerido en mayor proporción en el proceso de fijación biológica del nitrógeno, actúa como estabilizador de las cubiertas del heterocisto en las cianobacterias, principal barrera protectora para la nitrogenasa y el control al acceso del oxígeno. En el caso de Frankia spp. que posee estructuras esféricas multicelulares especializadas rodeadas de una cápsula que consiguen resistir hasta una concentración de oxígeno del 80%, debido a que presentan una cubierta multilaminar de naturaleza lipídica, similar a la de los heterocistos, la lámina de glucolípidos, principal barrera contra la difusión de oxígeno, susceptible de interac interactuar con B . Además, el B juega un papel importante en la relación B-Ca²⁺, donde el Ca²⁺ es preponderante en los procesos de iniciación del nódulo y el B en la estructura del mismo y las interacciones planta-actinomiceto, como son la formación de la pared celular del nódulo y estructura de la membrana (Bolaños et al 2000). (Figuras 5c,5d)

De acuerdo, a la Figura 7 se observa un estancamiento en el crecimiento entre las semanas 4 y 12, esto podría ser posible por presentarse en ese lapso de tiempo una época intensa de lluvias, lo cual que puede incidir en el estancamiento y va de acuerdo a lo encontrado por Díaz y Bahamón (1990) donde establecieron tres parcelas de Alnus acuminata H.B.K. a diferente altitud en el departamento de Caldas y encontraron que durante las épocas de mayor precipitación se presentó la máxima defoliación y la interrupción del crecimiento diamétrico. 

En general se reconoce que las tasas de crecimiento de las especies arbóreas de trópico alto son menores que las especies en crecimiento en trópico bajo; sin embargo, especies como la acacia japonesa (Acacia decurrens) en un sistema silvopastoril de trópico alto implementado en el corregimiento de Santa Elena Antioquia a 2350msnm y 15⁰C presentó una alta tasa de crecimiento 70cm a la edad de 150 días (0.46cm/día) y 3.21m a los catorce meses con un diámetro a la altura del pecho (DAP) de 8.22cm (Giraldo 2000). La tasa de crecimiento estimada en el estudio fue de 38.47cm en 120 días (0.32cm/día), con una tendencia a un mayor incremento en el tiempo como se observa en la Figura7.

En Caldas (Colombia) se ha encontrado un rendimiento medio anual de 12.6 m³/ha/año, a la edad de 19 años y un índice de sitio promedio de 21m, así mismo, se han encontrado tasas de crecimiento de 0.33cm/día en 60 días en vivero (Restrepo 2002; García 1990; Ruiz 1985; Escobar et al 1983). Resultado similar al reportado en la investigación el cual fue de 0.326cm/día, donde la inoculación con las cepas U presentó valor mas alto de 0.34cm/día.

Concentración de nitrógeno

La concentración de nitrógeno foliar, 2.29% como promedio general para todos los tratamientos, es un valor relativamente alto (Entrevista con Francisco Hernando Orozco, septiembre 28 de 2005). Este valor equivalente en proteína a 14.33%, que desde el punto de vista del ecosistema representa un aporte importante del aliso al componente suelo e indirectamente a las otras especies vegetales del sistema, debido a que esta especie es de alta renovación foliar (Tabla 12). 

De acuerdo a los tratamientos en la concentración de nitrógeno como se observa en la Figura 8 no hay diferencia en la concentración.

Sin embargo, dada la diferencia tan importante en biomasa a favor del tratamiento de inoculación el valor absoluto de nitrógeno debe corresponder a valores superiores del promedio de 2.50% reportado para condiciones óptimas por Escobar et al (1993) (Tabla 13).

En el análisis de varianza se encontró alta relación en la variable concentración de nitrógeno entre la interrelación BxMoxU al igual que los cinco factores BxCoxMoxNxU, lo que representa que todos los factores interactúan entre si para la concentración del nitrógeno foliar del Aliso (Alnus acuminata H.B.K); además, el factor Mo presentó un efecto positivo significativo (P<0.05) en la concentración de nitrógeno.

Este efecto en la concentración de nitrógeno, podría explicarse por dos causas, la primera el molibdeno interviene en el proceso de fijación de nitrógeno por la nitrogenasa y la segunda el componente de la enzima nitrato-reductasa y por lo tanto influye en la absorción de nitrógeno por la planta (Dixon and Wheeler 1986, Pérez y Torralba 1997) dado a que el efecto de la inoculación fue positivo probablemente hubo respuesta en la fijación de nitrógeno a la aplicación de este elemento. No obstante que el nivel de Mo encontrado en el suelo es relativamente alto (11.4mg/kg) cuando la literatura reporta 2mg/kg como nivel adecuado en el suelo; sin embargo se debe tener en cuenta el pH (4.4) el cual puede disminuir la disponibilidad del Mo presente en ese suelo.

Concentración de fósforo

En términos generales el promedio de la concentración de fósforo foliar es un valor relativamente alto (0.26%) frente al valor sugerido de 0.10% por Escobar et al 1993 (Tabla 13), lo que representa desde el punto de vista del ecosistema un aporte importante al componente suelo e indirectamente a otras plantas del sistema. En la Tabla 14 y Figura 9 se observa en el testigo un promedio muy alto (0.49%) que se podría explicar por una menor dilución dado que en biomasa (representada en altura y diámetro) los demás tratamientos presentaron un efecto superior.

Además, la alta concentración de fósforo puede indicar acumulación del mismo por un desorden fisiológico que no permite el adecuado aprovechamiento del mismo, como podría ser la carencia o el exceso de otros elementos que si estuvieron presentes en los demás factores, lo cual podría incidir en la menor concentración presentada por estos.   Con el análisis de varianza se encontró alta relación de la variable concentración de fósforo con la interrelación de BxMoxNxU, las cepas N y las cepas U (NxU); al igual que interrelación MoxU, y CoxMoxN, CoxN y BxMo. De acuerdo al análisis por factores de manera independiente, el factor Co (Cobalto) presentó un efecto negativo significativo (P<0.05) en la concentración del fósforo (Figura 9).

En efecto negativo presentado por el factor Co se puede asumir por posibles interacciones que se presentaron entre los micronutrientes y ambos grupos de cepas (NxU), lo cual no es muy claro y se requiere de otros análisis químicos, físicos y microbiológicos del suelo más profundo. Así mismo, en un estudio realizado por Rojas et al (2002), se encontró que la actividad de la nitrogenasa en semillas de aliso rojo fue influenciada por interacciones entre macronutrientes y el hongo micorrizal (Alpova). Contrario a las expectativas, adicionando micronutrientes a la combinación de Frankia spp. y macronutrientes, se eliminó el efecto benéfico de esas adiciones. El efecto negativo de micronutrientes en la actividad de la nitrogenasa fue inesperado; Co, Cu, Fe, B, Mo y Ni se sabe que son importantes en la nodulación y la actividad de la nitrogenasa de leguminosas, se asumió que esa fertilización con micronutrientes pudo ser sustituida al menos en parte por hongos micorrizógenos y Pseudomonas. No es claro porque ocurrió lo opuesto. Los micronutrientes fueron adicionados en medidas recomendadas para Alnus spp., pero cantidades recomendadas de fertilización son a menudo considerablemente superiores que aquellas que ocurren naturalmente y pueden resultar en respuestas negativas por toxicidad, es posible que la concentración relativamente amplia adicionada como fertilizante induzca un desbalance biológico en semillas en la rizósfera, a lo mejor favoreciendo el crecimiento competitivo de microorganismos patógenos. El efecto amortiguante aparente de Alpova puede ser debido a la habilidad de los hongos para proteger la planta por incrementar esa tolerancia a toxinas y patógenos del suelo (Rojas et al 2002). Lo anterior podría haber sucedido en el trabajo donde al medir las cantidades para el cobalto lo cual es por partes por billón se induzca a un desbalance de micronutrientes en el suelo y la planta.

Se conocen interacciones de fósforo con algunos otros elementos especialmente catiónicos y aniónicos como el Mo, que según Olsen (1971) pueden ser positivas o negativas. Así mismo, en un estudio realizado por Rojas et al (2002), se encontró que la actividad de la nitrogenasa en semillas de aliso rojo fue influenciada por interacciones entre macronutrientes y el hongo micorrizal (Alpova). Contrario a las expectativas, adicionando micronutrientes a la combinación de Frankia y macronutrientes, se eliminó el efecto benéfico de esas adiciones. Igual que en este trabajo, para Rojas et al (2002), no es claro porque ocurrió este efecto negativo a pesar de que los micronutrientes fueron adicionados en dosis recomendadas para Alnus spp.

En este trabajo era posible esperar toxicidad por cobalto debido a que la concentración del suelo era alta, sin embargo esta toxicidad pudo haber sido inducida por la interacción con el fósforo. Se requiere de otros análisis químicos, físicos y microbiológicos del suelo para explicar el fenómeno.

Conteo de esporas de HMA

En el análisis de conteo de esporas al final del ensayo (Figura 10), las esporas de la cepa UdeA1907, adaptada a estas condiciones agroambientales del suelo se observaron en todos los tratamientos inclusive en el no inoculado como era de esperarse; además, el número de esporas aumentó con algunos tratamientos en especial los mas complejos, en cambio para las esporas MICUNMS 32 se observa que solamente está presente donde fue inoculada con los micronutrientes aplicados.  

Se observa una diferencia significativa por el efecto de la inoculación de la cepa N lo que demuestra que la inoculación con la misma cepa que está presente en el suelo incrementó la población de la misma. Además, puede observarse en la Figura 10 la ausencia de esporas de la cepa U en donde ella no fue inoculada.

Los niveles de esporas en los tratamientos donde hubo respuesta fueron similares o aún superiores a las esporas ecológicamente adaptadas, especialmente cuando se aplicó B y Mo y por último el Co.

En el caso del tratamiento de la cepa N con el Mo y Co (B₀ Co₁ Mo₁ N₁ U₀) existió una interrelación negativa ya que presentó un menor número de esporas y un efecto positivo en la cepa U(tratamiento B₀ Co₁ Mo₁ N₀ U₁); lo que no se presentó en el tratamiento con Mo y Co (B₀ Co₁ Mo₁ N₀ U₀). La interrelación micorriza en ambas cepas (NyU), Frankia spp. y microelementos fue positiva para este parámetro (Figura 10).

Los resultados encontrados están acordes con lo reportado por Barea (2003) y Sánchez (1998) en micorrización controlada en viveros, pero en este trabajo, en campo igualmente se observó alta producción de esporas de la cepas introducidas, las cuales no se presentaban en estos suelos, lo que demuestra que estas cepas son competitivas.

Según el análisis de correlaciones entre variables, no se encontró correlación entre este parámetro y las variables estudiadas, como sucede frecuentemente, debido a que el comportamiento del número de esporas no representa efectividad de la misma, aunque éste parámetro puede ser válido para la sobrevivencia.

Análisis longitudinal en el tiempo del experimento.

En el análisis longitudinal se encontró relación del efecto de los factores y los tratamientos en el tiempo por períodos, donde el tratamiento que incluía los cinco factores analizados, presentó diferencia significativa mediante la prueba de Tukey con respecto a la mayoría de los tratamientos para las variables altura, crecimiento y diámetro. Los resultados muestran una influencia definida de los tratamientos a partir del tercer período analizado, lo que demuestra que esta especie por su lento crecimiento requiere de un proceso de adecuación de todos los factores estudiados para el logro de los resultados.

Los resultados de este trabajo confirman lo encontrado por Ganio et al (2002) quien estudió el efecto de Frankia spp., macronutrientes, micronutrientes y hongos micorrizógenos sobre el peso de nódulos, la biomasa total y la fijación de nitrógeno durante la siembra y el crecimiento del aliso rojo (Alnus rubra) bajo condiciones de invernadero durante 6 y 12 meses. Las plantas que fueron inoculadas con los cuatro factores incrementaron la fijación de nitrógeno en un 136% por encima del control. Al utilizar micorrizas se incrementó la fijación de nitrógeno en un 33% más que el obtenido con Frankia spp. y macronutrientes. Y también a lo encontrado por Oliveira et al (2005) En alnus negro (Alnus glutinosa) quienes reportan un efecto superior en desarrollo por la inoculación conjunta de Glomus intrarradices con Frankia spp. que cuando se emplearon cada uno de los microorganismos por separado e igualmente la doble inoculación favoreció el contenido de nitrógeno y fósforo en las hojas en suelos degradados con pH alto.

Conclusiones 

• El tratamiento con todos los factores (B₁Co₁Mo₁N₁U₁) aplicados al aliso presentó el mejor resultado en la tasa de crecimiento con respecto a la mayoría de los tratamientos en donde se utiliza cada factor en forma individual. Esto comprueba la hipótesis 1 inicialmente planteada.

  
  

• El análisis del promedio de todos los tratamientos que incluían cada factor, mostró que partir del tercer período hubo un efecto significativo (P<0.05) en la tasa de crecimiento con el factor cepas U (CUNMS502 y MICUNMS32) con respecto a los demás factores evaluados.

  
  

• La respuesta a los tratamientos sólo se evidenció a partir del cuarto período, lo que indica que la experimentación a corto plazo con esta especie debe ser revaluada.

  
  

• La aplicación de Co mostró un efecto positivo en la altura, lo cual se manifiesta en la tasa de crecimiento del aliso, a pesar de que mostró un efecto antagónico con la concentración de fósforo foliar. Mientras que el B presentó un efecto positivo en la variable diámetro y el Mo en la concentración de N foliar.

  
  

• Considerando que las cepas U (reconocidas) tuvieron un mejor comportamiento que las N (adaptadas a la zona), no se demostró la segunda hipótesis del trabajo. Se considera que a pesar de la alta concentración de esporas adaptadas a la zona de estudio encontradas en el trabajo, es necesaria la aplicación de hongos HMA ya evaluados en otras zonas para la misma especie.

Recomendaciones 

Aunque el mejor tratamiento en la tasa de crecimiento de aliso fue con todos los factores (microelementos y los microorganismos evaluados; B₁ Co₁ Mo₁ N₁ U₁), en la práctica de acuerdo a los costos, tiempo y recursos; con la aplicación únicamente de las cepas U se logran efectos similares en la tasa de crecimiento de la especie evaluada.

Realizar una evaluación de ecotipos de la zona tanto de Frankia spp. como de HMA, debido a que según los resultados de este trabajo no funcionaron los ecotipos adaptados a la región, como se esperaba respecto a los introducidos; ya que en numerosos trabajos se ha encontrado que los organismos de la misma zona presentan mejor respuesta.  

Agradecimientos

Los Autores expresan sus agradecimientos al Doctor Hernando Orozco por sus valiosos aportes, asesoría y gran colaboración durante todas las etapas del desarrollo del proyecto. A la UMATA del Municipio de Jardín (Antioquia. A CORANTIOQUIA por la financiación del proyecto.

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Received 8 August 2007; Accepted 26 November 2007; Published 4 April 2008

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