Utilisation des enzymes coagulantes extraites de dromadaire pour la coagulation du lait bovin

Boudjenah-Haroun Saliha, Souid Wafa, Balla Asma, Senoussi Chahra*, Almi Dalila*, Si Ahmed Saliha* et Mati Abderrahmane*

Univ Ouargla, Fac.des sciences de la nature et de la vie, Lab. de Recherche sur la Phœniciculture, Ouargla 30000 Algeria
haroun@yahoo.fr
* Laboratoire de Biochimie Appliquée et de Biotechnologie (LABAB), Université M. Mammeri de Tizi Ouzou, Algérie

Résumé

Les travaux de recherches récemment publiés ont montré que les enzymes coagulantes extraites de dromadaire étaient efficaces pour la coagulation du lait de chamelle notamment les extraits issus des animaux âgés. L’objectif de ce travail est d’étudier la possibilité de substituer la présure commerciale par ces extraits pour la coagulation du lait bovin. Les extraits coagulants bruts de dromadaire, sont caractérisés à travers leurs teneures en protéines et leurs activités coagulante et protéolytique. Les conditions de coagulation (pH et température) du lait par action de ces extraits ont été optimisées. Le temps de coagulation du lait traité par toutes les préparations enzymatiques et dans différentes conditions a été calculé. La présure commerciale a été utilisée à titre comparatif.

Les résultats obtenus montrent les extraits gastriques bruts issus de dromadaires âgés sont ceux qui donnent toujours de meilleurs résultats. Le meilleur temps de floculation du lait est obtenu à un pH 6 et une température de 42°C. L’évaluation sensorielle des caillés obtenus et l’étude de leur texture rehausse la possibilité d’utiliser les extraits coagulants de dromadaire âgé comme succédané de la présure commerciale.

Mots clés: Algérie, extraits gastriques, fromage, protéases, Sahara

Coagulating bovine milk with enzymes extracted from camel milk

Abstract

Research work published recently showed that gastric enzymes extracted from the abomasums of camels (Camelus dromedaries) were effective for coagulation of camel milk including extracts from older animals. The objective of this work is to study the possibility of replacing commercial rennet by these extracts for bovine milk coagulation. Raw camel extracts coagulants (EC) are characterized through their protein content and coagulant and proteolytic activities. Coagulation conditions (pH and temperature) of these extracts were optimized. The clotting time of the treated milk and all enzyme preparations under different conditions was calculated. Commercial rennet was used for comparison.

The data showed that the extacts from the older camels gave the best results. The best flocculation time was obtained at pH 6 and a temperature of 42°C. Sensory evaluation of obtained curds and the study of their texture enhances the possibility of using extracts coagulants of old camels as a substitute for commercial rennet.

Keywords: Algeria, cheese, gastric extracts, proteases, Sahara

Introduction

La transformation du lait en fromage est une méthode de conservation de lait très largement utilisée dans le monde au plan artisanal et industriel. Son élaboration est souvent réalisée grâce à l’emploi d’enzymes coagulantes dont le tonnage et la diversité sont en constante évolution. Ainsi différentes protéases capables d’hydrolyser la caséine Κ du lait peuvent provoquer la coagulation de ce dernier et permettre la fabrication de produits dérivés.

Toutefois, cette condition n’est pas toujours suffisante pour une large utilisation en industrie de transformation du lait car le rapport de l’activité coagulante et de l’activité protéolytique sont déterminants pour le choix de l’enzyme à sélectionner. La présure qui est une préparation enzymatique extraite de caillette de jeunes veaux nourris au lait (et sacrifiés avant sevrage) est l’agent le plus utilisé pour la coagulation du lait (Desmazeaud 1997).

Bien que cette enzyme coagulante soit encore la plus utilisée en fromagerie, sa production connaît une pénurie mondiale croissante. Cette pénurie est due essentiellement à une augmentation croissante de la production et la consommation du fromage, et l’impossibilité d’augmenter en parallèle la production de présure. Cette pénurie a provoqué des fluctuations très importantes de son prix (Cuvellier 1993). De nos jours son utilisation est confrontée à la contrainte majeure de sacrifice de jeunes veaux et donc d’obtention de quantité de plus en plus importante d’enzymes susceptible de répondre à des besoins sans cesse croissants.

En effet, l’augmentation de la production laitière mondiale et l’accroissement global de la consommation du fromage ont accentué cet handicap et ont impulsé un effort de recherche particulier pour explorer les voies de remplacement de la présure par d’autres enzymes coagulantes d’origine animales, végétales et microbienne.

L’Algérie qui connait une dépendance totale de nos laiteries en ingrédients de fabrication, se doit de participer à cet effort surtout que la production nationale en lait cru et la consommation des produis laitiers connaissent une augmentation substantielle pendant ces dernières années.

Dans cette optique, nous nous sommes proposé, de voir dans quelle mesure l’extrait enzymatique isolé de dromadaires à différents âges (8 mois ,18 mois et 5 ans) pouvait constituer un succédané de la présure pour la coagulation du lait de bovin.

Matériel et Méthodes

Les caillettes proviennent de dromadaires sélectionnés, selon leur âge. Après l’abattage au niveau de l’abattoir communal d’Ouargla, le dernier tiers du troisième compartiment de leurs estomacs est prélevé. Ces caillettes issues de dromadaires âgés de 8 mois, 18 mois et de 5 ans, sont lavées, dégraissées, découpées en lanières puis conservées à -18 °C. La poudre du lait bovin écrémé de type « Low heat » a servi comme substrat standard pour la mesure de l’activité coagulante. La poudre de la présure bovine a été utilisée pour les essais comparatifs.

Le lait de vache utilisé est un mélange issu de la traite du matin de vaches en stabulation dans une ferme située dans la ville d’Ouargla.

L’appréciation de la qualité microbienne du lait est réalisée par le test de la réductase ( Guiraud 1998). Il s’agit de la mesure du temps de décoloration du lait additionné du bleu de méthylène et incubé au bain-marie à 37°C. La décoloration due au métabolisme microbien, évolue à une vitesse proportionnelle au nombre de germes dans le lait. De ce fait, la durée de la décoloration nous permet de quantifier approximativement la population microbienne du lait et par conséquent d’estimer sa qualité microbiologique.

L’obtention des extraits coagulants gastriques de dromadaire est réalisée selon la méthode décrite par Valles et Furet (1977). Des échantillons de caillettes préalablement décongelées, de poids P (en g) chacun, sont macérés à 42 °C dans un volume (V = 1.25 x P) d’une solution d’acide chlorhydrique 0.2 M pendant 60 minutes. Après filtration de chaque mélange on obtient des extraits enzymatiques bruts. Ces derniers subissent alors une clarification par addition d’1% (V/V) d’une solution de sulfate d’aluminium (AlSO₄) 1M et de 5 % (V/V) d’une solution de sulfate de sodium (Na2SO4) 1M à une température de 42°C. Après une deuxième filtration, nous obtenons un filtrat jaune auquel nous faisons subir une concentration par addition d’une solution saturée de NaCl additionnée à 1% (V/V) d’une solution de HCl (d= 1.19). Après un repos d’une heure suivie d’une centrifugation (2100xg /20 min) nous obtenons un précipité humide que l’on fait dissoudre dans minimum d’eau distillée. Le pH de ces extraits enzymatiques gastriques camelins clarifiés est ajusté à 5.5 par une solution de phosphate dissodique 1M. Nous les avons dénommés ECD8 (extraits issus des animaux âgés de 8 mois, ECD18 (extraits issus des animaux âgés de 18 mois) et ECD5 (extraits issus des animaux âgés de 5 ans).

La conservation de ces ECD est réalisée à 4°C après addition de quelques grains de thymol.

La caractérisation des extraits coagulants gastriques consiste en la détermination de leur teneur en protéines et de leurs activités coagulante et protéolytique.

La détermination de la teneur en protéines des extraits coagulants est effectuée par la méthode de Lowry et al (1951). Cette teneur en (µg/ml) est obtenue grâce à une courbe d’étalonnage réalisée en utilisant le sérum albumine bovine (BSA). Le pouvoir coagulant de ces protéases est déterminé par la mesure de l’activité coagulante. Cette activité s‘exprime par la rapidité avec laquelle l’enzyme employé coagule le lait. Elle est testée sur du lait écrémé par mesure du temps de floculation à 30°C selon la méthode de Berridge (1955). Le temps de floculation correspond à la durée s’écoulant depuis l’addition de l’extrait enzymatique jusqu’à l’apparition de fins flocons sur la paroi interne du tube à essai.

L’unité d’activité coagulante (U.A.C.) ou "unité présure" (U.P.) est définie comme étant la quantité d’enzyme par millilitre d’extrait enzymatique qui provoque la floculation de 10 ml de substrat en 100 sec à 30 °C et elle est calculée comme suit:

UP=10×V/ T_c× Q

UP : unité présure

V : volume de substrat standard utilisé (ml)

Q : volume d’extrait coagulant (ml)

T_c : temps de coagulation (secondes).

La mesure de l’activité protéolytique des extraits bruts est basée sur l’intensité de la protéolyse des caséines camelines en solution, sous l’action enzymatique de ces extraits. Le substrat caséinique est obtenu par une solubilisation à 2% (P/V) dans l’eau distillée, des caséines bovines lyophilisées séparées selon la méthode de Schamet et al (1992). La mesure de la protéolyse est effectuée après un repos de 15min à la température ambiante du mélange filtré et enfin a lieu la détermination de l’absorbance à 280nm. Les différentes solutions peptidiques obtenues, sont appelées (SP8), (SP18) et (SP5).

La coagulation du lait par les ECD est estimée, par l’évaluation du temps de floculation (le temps écoulé depuis l’emprésurage jusqu’à l’apparition des premiers flocons visibles à l’œil nu.

La concentration de l’extrait coagulant (EC) est telle que la floculation du lait au pH = 6.3 (à une concentration de CaCl₂ de 0.01 M et à 30 °C) a lieu après environ 15 minutes.

Une analyse sensorielle des fromages (caillés) traités par les deux enzymes (l’extrait coagulant adulte EC5 et la présure commerciale) a été réalisée par un jury composé de 20 personnes.

Cette évaluation sensorielle est ensuite renforcée par une analyse du profil de texture (TPA) avec des options appliquées à l'analyse du fromage (Xinhuai et Xiaoting 2009), qui est pratiquée pour déterminer les caractéristiques physiques des deux caillés Avant d’entamer ces essais, les caillés sont mis hors du réfrigérateur et conservés à la température ambiante pendant 1 h avant le test. Pour l'échantillonnage, un carottier en acier inoxydable avec un diamètre interne de 23 mm a été utilisé. Chaque échantillon a été coupé à une hauteur de 20 mm et placé sur la plaque de l'analyseur de texture. Une sonde en acrylique de 10 mm de diamètre (P/0.5) a été utilisée. Chaque échantillon a été comprimé axialement à 50% de leur hauteur initiale. La vitesse d'essai, le temps, la distance et la force de déclenchement sont respectivement de 5 mm · s^-1, 5,0 s, 10,0 mm et 5,0 g. La dureté, l’adhésivité, la cohésion et l'élasticité ont été les paramètres calculés par l'instrument.

Les données ont été exprimées en moyenne de trois répétitions ± écart-type. La comparaison des moyennes et la signification des essais ont été analysées en utilisant un logiciel SPSS 17.

Résultats et discussions

La fraicheur du lait collecté a été évaluée par l’estimation de sa charge en micro-organismes mésophiles. Le test sommaire de la réductase appliqué a montré, pour l’ensemble des échantillons analysés, que la décoloration du bleu de méthylène a lieu à des durées supérieures à 5 heures. La rapidité de la décoloration du bleu de méthylène est directement proportionnelle au nombre des germes présents. Ce lait, qui pourrait avoir de ce fait une charge microbienne comprise entre 2 ×10⁵ et 2 ×10⁶ bactéries / ml (Larpent 1977), peut être considéré comme ayant une bonne qualité hygiénique. Cette qualité est exigée avant toute transformation du lait.

Les taux moyens des protéines exprimés en (g/l) des extraits EC 8, EC 18 et EC 5 sont représentés dans le tableau 1.

Les teneurs protéiques des extraits ont tendance à augmenter en fonction de l’âge de l’animal dont ils sont issus. La faible teneur est obtenue avec l’EC 8 et la plus grande avec l’EC5. Sachant que les trois EC sont préparés dans les mêmes conditions expérimentales. Valles et Furet (1977) ont constaté que la richesse enzymatique des caillettes dépend de la race, de l’âge et du sexe de l’animal.

D’après les analyses statistiques, les trois extraits différent significativement par leur activité coagulante (p<0.05). De ce fait, ils appartiennent chacun à un groupe .La valeur la plus élevée est observée pour l’EC5. L’activité de ce dernier se rapproche de celle de la présure bovine. L’étude de l’effet de chaque extrait enzymatique (EC8, EC18, EC5) sur l’hydrolyse des caséines du lait bovin à aboutit aux résultats illustrés par la  Figure1.

Figure 1: L’absorbance des solutions peptidiques issues de l’hydrolyse des caséines bovines traitées par les différents EC. SP8 : Solution peptidique obtenu avec l’extrait gastrique coagulant de dromadaire de 8 mois SP18 : Solution peptidique obtenu avec l’extrait gastrique coagulant de dromadaire âgé de 18 mois SP5 : Solution peptidique obtenu avec l’extrait gastrique coagulant de dromadaire âgé de 5ans. La différence de moyenne est significative ( p = 0.003)

L’absorption de la lumière à 280nm est proportionnelle aux taux de peptides existants dans la solution considérée. Etant donné que ces peptides sont libérés au cours de l’hydrolyse enzymatique, il s’avère que l’EC8 libère plus de peptides que l’EC18 au moment où la faculté de libération des peptides est la plus faible pour l’EC5. Par ailleurs, on sait que lors de la coagulation du lait, il y a hydrolyse enzymatique plus ou moins importante, des caséines du lait avec libération de peptides. Ces peptides s’ils sont en grandes quantités confèrent aux fromages un goût amer (Siboukeur et al 2005). Comme pour toutes les préparations enzymatiques, l’activité protéolytique de la présure au même titre que l’activité coagulante est fortement influencée par les facteurs du milieu en particulier par le pH et par la température. L’activité protéolytique des EC est inversement proportionnelle avec l’âge des dromadaires d'où ils sont issus. En industrie fromagère, on recherche toujours à ce que les enzymes coagulantes utilisées aient une activité coagulante élevée et une activité protéolytique faible (Ramet 1997). L'EC5 semble par conséquent, le mieux indiqué par rapport aux autres EC.

Les temps de floculation (tf) mesurés, en fonction de la nature de l’enzyme dans une température de 30°C et pH de 6, est illustré par la  Figure (2).

Il ressort de cette  Figure que le temps nécessaire pour la floculation du lait bovin, varie selon l’âge de l’animal. Le tf le plus bas est enregistré pour l’EC 5 et que ce temps est voisin de celui enregistré pour la présure bovine habituellement utilisée pour la coagulation du lait bovin ce qui renforce la possibilité de substituer la présure par ces extraits coagulants de dromadaire notamment les adultes.

Figure 2: Variation du temps de floculation du lait bovin en fonction de l’enzyme utilisée. La différence de moyenne est significative (p = 0.031)

Figure 3: Variation du temps de floculation du lait bovin traité par les EC en fonction du pH. EC8 = Extrait Coagulant issu de dromadaire âgé de 8 mois; EC18= Extrait Coagulant issu de dromadaire âgé de 18 mois ; EC5 = Extrait Coagulant issu de dromadaire âgé de 5ans ; La différence de moyenne est significative (p = 0.027)

Les résultats de l’étude statistique (anova) ont montré que la nature de l’enzyme utilisée à un effet très significatif sur le temps de floculation (p< 0,05). Les conditions de la floculation ont été optimisées en faisant varier le pH et la température. Les résultats sont représentés par les  Figures 3 et 4.

Figure 4: variation du temps de floculation du lait bovin traité par les EC en fonction de la température EC8 = Extrait Coagulant issu de dromadaire âgé de 8 mois; EC18= Extrait Coagulant issu de dromadaire âgé de 18 mois ; EC5 = Extrait Coagulant issu de dromadaire âgé de 5ans ; La différence de moyenne est significative (p = 0.021)

En se basant sur les résultats des analyses de l’anova, nous pouvons dire que l’effet du pH est très significatif (p=0.001). L’évolution du temps de floculation du lait bovin, en fonction du pH ( Figure 3) a montré que le pH optimum de tous les EC est de 6. Nous remarquons aussi que l’EC5 est le moins sensible aux variations du pH par rapport aux EC8 et EC18. Nos résultats concordent avec ceux obtenus par Chazarra et al (2007). Le pH de floculation est particulièrement important à prendre en considération au niveau technologique car l’acidification favorise l’activité de l’enzyme, qui est une protéase, ayant une activité optimale généralement située autour du pH 5.5 et au même temps elle contribue à la déstabilisation des micelles de caséines (Ramet 1994).

L’élévation de la température, (mesurée entre 30 et 42° C), s’accompagne d'une diminution du temps de floculation du lait traité par les ECD. Le temps de floculation le plus court est observé pour l’EC5 et à la température de 42°C ( Figure 4).Notons que cette température est l’optimale pour tous les EC.

La température optimale de l’activité des enzymes coagulantes se situe pour la plupart au voisinage de 40-50C° ; au dessus de cette valeur, se produit une dénaturation progressive de l’enzyme qui devient complète vers 65C° (Ramet 1993).En pratique, elle est comprise entre 20-22 C° pour les pâtes fraîches et 30-42C° pour les pâtes dures (Ramet, 1997). Par ailleurs, Farah et al (1987) ; Mehaia (1992) ; Ramet (1993) ont montré l’existence d’une relation presque linéaire entre la température et l’activité des préparations coagulantes dans l’intervalle de température de 25 à 40°C. Selon Desmazeaud (1990) la vitesse de coagulation enzymatique du lait par la présure serait maximale entre 40 et 42°C. Cette vitesse diminue progressivement au-dessus de ce seuil (Thouvenot 1997). Sur la base de ces résultats, nous préconisons une température optimale de 42°C et un pH de 6 pour une meilleure activité des extraits enzymatiques d’origine cameline.

Les fromages obtenus en coagulant le lait par les deux préparations enzymatiques (EC5 et la présure commerciale) ont été présentés devant un jury de dégustation. Ce dernier n’a exprimé aucune distinction, entre les deux que ce soit sur le plant organoleptique de point de vue aspect général.

L’étude de la texture (par utilisation de TPA : analyse du profil de texture) des deux caillés obtenus a révélé que ces caillés sont caractérisés par les paramètres consignés dans le tableau 3.

D’après le tableau 3, nous remarquons que tous les paramètres se ressemblent pour les deux caillés bovins traités différemment. L’analyse du profil de texture permet d’accéder à des grandeurs discriminante corrélées à l’analyse sensorielle (Brown et al 2003 ; Everard et al 2006). Il faut cependant veiller à ce que les conditions de réalisation du test soient proches de l’analyse sensorielle (Foegeding et Drake 2007). Les méthodes instrumentales sont ainsi intéressantes pour remplacer l’analyse sensorielle dans certaines conditions à cause de leur rapidité, de leur moindre coût et des résultats reproductibles qu’on obtient.

L’utilisation de ces enzyme serait parmi les facteurs de réajustement à envisager pour constituer un succédané de présure pour la coagulation du lait bovin .Cette perspective est d’autant plus intéressante quand on sait que des extraits contenant ces enzymes, peuvent être obtenus en quantité, vu la relative disponibilité des dromadaires adultes destinés à l’abattage.

Conclusion

• Cette étude a été entreprise dans le but de contribuer à la possibilité de substitution de la présure par les extraits coagulants de dromadaire lors de la coagulation de lait bovin. Pour atteindre cet objectif, nous avons été emmené à réaliser l’extraction des enzymes coagulantes à partir des caillettes de dromadaires, d’âges variés. Les préparations enzymatiques brutes testées sur leur pouvoir de coagulation de lait bovin ont montré que les meilleures aptitudes correspondent à celles issues de l’animal le plus âgé (EC 5). L’étude du temps de floculation a permis d’affirmer qu’il y a une bonne affinité des extraits coagulants de dromadaire pour le lait bovin. Les essais réalisés ont aussi montré que la réduction du temps de floculation est possible en ayant recours à des extraits coagulants de dromadaires adultes utilisés à un pH d’emprésurage voisin de 6 et à des températures avoisinantes 42°C. Ce résultat est très encourageant vu la pénurie mondiale de la présure et les fluctuations de son prix suite à quoi son importation présente un handicap majeur pour le développement de la production locale. Pour cela, le choix d'un succédané de présure de production locale, est souhaitable. Il permettrait un approvisionnement permanent limitant la dépendance avec l’importation et les fluctuations de prix .Ce résultat est aussi prometteur étant donné la disponibilité des caillettes de dromadaires adultes prêts à l’abattage dans le sud Algérien.

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Received 3 January 2013; Accepted 12 February 2014; Published 1 March 2014

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