Polimorfismo de las fracciones caseínicas de la leche en bovinos holstein del Trópico Alto de Nariño

C E Solarte Portilla, C Y Rosero Galindo, Y M Eraso Cabrera, G L Zambrano Burbano, D C Barrera, O A Martínez, M L Guerrón y F P Cháves Galeano

Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Pecuarias - Grupo de Investigación “Producción y Sanidad Animal” Línea de Mejoramiento Genético. A.A 1175, Pasto, Colombia
csolarte@udenar.edu.co

Resumen

Una de las múltiples aplicaciones de los estudios moleculares multiloci es el conocimiento de los niveles de endogamia en la población. El análisis de las caseínas en una población de vacas holstein del Trópico Alto de Nariño permitió detectar estructura genética negativa (F_ST = -0.00151) entre dos distritos lecheros y presencia de endogamia (F_IS =  0.08931).

 El porcentaje de endogamia estimado fue 6.25%,  cifra superior a la normalmente aceptada para los bovinos lecheros  y cercano al porcentaje de consanguinidad proyectado para la raza holstein en el año 2020. Estos hallazgos confirman la necesidad urgente de revisar  los actuales programas de apareamiento y utilizar los cruzamientos entre el ganado holstein y otras razas taurinas, con el objetivo de mejorar la calidad composicional de la leche mediante  el  efecto de la heterosis y al mismo tiempo contrarrestar los efectos de la depresión por endogamia, en esta zona ganadera del sur de Colombia.  

Palabras Clave: Alfa S1, Alfa S2, Beta caseína, PCR, RFLP

Polymorphism of the casein fractions of milk in Holstein cattle of the Alto de Nariño tropics

Summary

One of the many applications of multiloci molecular studies is finding information about inbreeding levels in the population analyzed. The analysis of the caseins in a Holstein population at the Trópico Alto of  Nariño, Colombia, allowed researchers to detect a negative genetic structure (FST = -0.00151) and inbreeding between two dairy districts (FIS = 0.08931) of the above mentioned region.

The estimated rate of inbreeding was 6.25%, which is higher than the normally accepted rate for dairy cattle. This percentage is close to the projected rate of inbreeding for the Holstein breed in 2020. These findings confirm that there is a pressing need to review existing breeding programs, and use the crosses between the Holstein and other breeds to improve the milk compositional quality through the heterosis effect and, at the same time, counteract the effects of inbreeding depression. 

Key Words: Alpha S1, Alpha S2 and Beta casein, PCR- RFLP

Introducción

Entre las principales fracciones caseínicas de la leche se encuentran la  Alfa s1 caseína (αs1-Cs), Alfa s2 caseína (αs2-Cs), Beta caseína (β-Cs) y la Kappa caseína (K-Cs), que a su vez se caracterizan por tener una coagulación más firme por  acción del cuajo o por acidificación a pH cercano a 4.6 (Webb et al1980; Alais 1985; Fennema 1993).

El estudio de las caseínas lácteas se incrementa día a día con el propósito de brindar soluciones a la industria, fundamentalmente aumentando los rendimientos en productos como los quesos que requieren gran cantidad de leche para su transformación.  El análisis de estas proteínas permite mejorar la calidad de leche en cuanto a grasa y proteína se refiere, desarrollando un alto potencial industrial, obteniendo diversificación de los productos en sus diferentes variedades y reducción en los costos operacionales. 

En la última década los estudios relacionados con el sector pecuario y específicamente con el ganado bovino, están estrechamente relacionados con la posibilidad de usar marcadores genéticos asociados a caracteres de producción, como una ayuda en la selección de caracteres cualitativos y cuantitativos, ya que ofrecen información sobre la identificación, distinción y estimación de distancias genéticas entre poblaciones, líneas puras e híbridos, en el establecimiento de relaciones de parentesco (Días et al 2009). Los marcadores moleculares han revolucionado el análisis genético, basado en la información contenida en el ADN convirtiéndose en una herramienta fundamental para determinar genes de importancia económica para la ganadería especializada en leche. A este respecto, un estudio reciente realizado en el Trópico Alto de Nariño evidenció una relación directa entre el genotipo de la K-Cs con el rendimiento industrial en cuajada (Zambrano et al 2010).

Estos resultados justifican la necesidad de continuar estudios en los cuales se incluya el conocimiento genético de la variación de los polimorfismos para las fracciones caseínicas de la leche bovina.  Nariño es considerada una región lechera que presenta bajos porcentajes de proteína, grasa y sólidos totales, pero con animales de alto potencial genético, razón por la cual, el Programa de Mejoramiento Genético de la Universidad de Nariño tienen como uno de sus objetivos caracterizar molecularmente las fracciones  αs1-Cs, αs2-Cs y β-Cs en un núcleo de hembras élite del Trópico Alto de esta zona ganadera, utilizando la técnica PCR- RFLP (por  sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Lenght Polymorphism). 

Materiales y Métodos

Selección de hembras.

Para la identificación de los polimorfismos en las fracciones caseínicas αs1-Cs, αs2-Cs y β-Cs,  se analizó una muestra poblacional de 103 hembras seleccionadas como donadoras para multiovulación. La selección de las hembras se realizó mediante valoración genética que incluyó el análisis de la producción de leche, porcentaje de proteína, porcentaje de grasa, intervalo entre partos y 22 características de conformación o tipo.  Este núcleo se encuentra distribuido en las cabeceras municipales de Pasto y Pupiales del departamento de Nariño-Colombia (Figura 1). 

Figura 1. Ubicación geográfica de los municipios de Pasto y Pupiales en el departamento de Nariño.

Toma de muestras

Se tomaron 5 ml de sangre de cada individuo mediante punción en la vena coccígea, la conservación de la sangre se realizó en tubos vacutainer^TM heparinizados con EDTA (figura 2). Posteriormente, los tubos fueron transportados en frío al laboratorio de Mejoramiento Genético de la Universidad de Nariño y se conservaron a 4ºC hasta dar inicio al estudio molecular.

Figura 2. Toma de muestras de sangre en hembras Holstein.

Extracción de ADN

La obtención de ADN se realizó, mediante el método Salting Out descrito por Ferreira y Grattapaglia 1998, modificado para micro-extracción en el Laboratorio de Mejoramiento Genético. La cuantificación de ADN se hizo por comparación visual entre los ADN extraídos y ADN de timo en concentraciones conocidas y equivalentes a 100 ng/µl y 10 ng/ µl (Biorad) (Figura 3).

Figura 3. Cuantificación de ADN por comparación utilizando ADN de Timo.

PCR-RFLPS

  Para la amplificación de los genes de las proteínas αs1-Cs, αs2-Cs y β-Cs, se utilizaron los cebadores descritos en la Tabla 1 y descritos, previos a este estudio, por diferentes autores.

En la Tabla 2, se describe las condiciones utilizadas para la amplificación de cada gen y modificadas en el Laboratorio de Mejoramiento Genético de la Universidad de Nariño utilizando el kit de amplificación Go Taq flexi (Promega).

La obtención de marcadores moleculares RFLPs, se realizó por digestión de cada producto amplificado vía PCR utilizando las siguientes condiciones: 10µl de producto PCR, enzima de restricción y 2 µl de buffer de restricción (Fermentas). 

En las reacciones de digestión se utilizaron por separado, 6U (unidades) de la enzima MaeIII para la identificación de las variantes alélicas B y C de la αs1-Cs; 1U de MboII, NlaIV y MnlI para la identificación, por separado, de las variantes alélicas B, C, y D para αs2-Cs y 20 U de MspI para identificar las variantes A y B de la β-Cs. La temperatura y tiempo de incubación para la digestión con cada enzima de restricción se describe a continuación: 55°C por 2 horas para MaeIII, 37ºC por 16 horas para MboII, NlaIV y MnlI y por último 37ºC por 2 horas para la enzima MspI.

La visualización de los productos digeridos se realizó en geles de agarosa al 4% con  tinción de Bromuro de etidio (10 mg/ml).  La identificación de cada variante se determinó de acuerdo al peso molecular del fragmento  y utilizando una escalera de peso de 50 pares de bases (Fermentas).

Análisis Estadístico

La estimación de la diversidad genética se realizó con el programa  Tools For Population Genetics Analisys, TFPGA (Miller 1997), se estimaron las frecuencias alélicas de cada fracción alélica y la heterocigosidad observada y esperada.

La desviación con respecto al equilibrio Hardy-Weinberg (H-W) para cada locus en cada distrito y para la población en general, se calcularon mediante el programa Arlequín versión 3.01 (Schneider et al. 2006) usando el método de Cadenas de Markov para 100.000 permutaciones según Guo & Thompson (1992) y corroborado con el programa Genpop.  El desequilibrio de ligamiento entre pares de locus polimórficos y para la población en general, se calculó por medio del programa Arlequín versión 3.01 (Schneider et al. 2006) empleando el método de Cadenas de Markov para 10.000 permutaciones según Slatkin (1994); Slatkin & Excoffier, (1996) y Lewontin & Kojima, (1960). 

La estimación de la estructura genética se realizó por Análisis de Varianza Molecular-AMOVA (Excoffier et al 1992) ejecutando 10.000 permutaciones con el programa Arlequín versión 2006 (Schneider et al 2006).  

Resultados y Discusión

Proteína láctea αs1-Cs

En la Figura 4a se observa la amplificación del fragmento para el gen de αS1caseína, el cual tiene un peso de 310 pb, fragmento que resultó coincidente con la descripción reportada por Koczan et al (1993). Se obtuvieron por digestión  tres fragmentos de restricción equivalentes a 310 pares de bases pb, 241 pb y 96 pb, lo que permitió a su vez identificar los genotipos  BB y BC (Figura 4b).  

De  acuerdo con Requena et al (2007) y Schlee y Rottmann (2011), el genotipo homocigoto BB se encuentra asociado con la característica producción de leche y el heterocigoto BC está relacionado con porcentaje de grasa, proteína, menor tiempo de coagulación y consistencia de la cuajada. 

Figura 4. a) Fragmento de 310pb de la proteína láctea αs1-Cs.  b) digestión de los productos amplificados.

Proteína láctea αS2

Se obtuvo un fragmento de 253 pb para el alelo B, 459 pb para el alelo C y 356 pb para el alelo D, de acuerdo con lo descrito por Ibeagha et al 2007 y se indica en la Figura 5.

Figura 5. Visualización de los Fragmentos para  de la proteína láctea  αS2 caseína. (a) variante B peso de 253pb. (b) variante C peso de 356. (c) variante D de 459pb.

Para identificar las variantes correspondientes a esta proteína, fue necesario realizar la digestión con tres enzimas de restricción MboII, NlaIV, MnlI. Tal como se indica en la Figura 6, únicamente fue posible observar un fragmento de 253 pb utilizando la enzima MboII cuyo resultado puede interpretarse como alelos A, C ó D. Por otra parte, con las enzimas NlaIV, se observa un corte de 459 pb, el cual corresponde a los alelos A, B, D. Finalmente, para la enzima MnLI, se aprecia claramente dos cortes de 196 y 169 pb correspondientes a los alelos A, B y C, es decir, que para la identificación de la variante αS2, fue necesario observar los alelos de cada digestión en cada individuo y así, identificar el genotipo correspondiente para esta proteína láctea (Ibeagha et al 2007).

Figura 6. Digestión de la proteína láctea α-S2 caseína con las enzimas de restricción MboII, NlaIV y MnlI.

Proteína láctea β-Cs

Se obtuvo una banda clara y nítida, para la proteína  β-caseína con un peso molecular de 233 pb, fragmento que coincide con el descrito por Medrano y Sharrow  1991 (Figura 7).

Figura 7. Fragmento de 233 pb de la proteína láctea β-caseína.

La visualización de los fragmentos de restricción permitió identificar las variantes alélicas A y B, según Medrano y Sharrow  (1991) (Figura 8).

Figura 8. Digestión de β-caseína con la enzima de restricción MspI. Homocigoto AA con un peso molecular de 208 y 25pb, homocigoto BB con un peso molecular de 233pb y el heterocigoto AB con un peso molecular de 233, 208 y 25pb.

El genotipo homocigoto AA de la proteína láctea β-caseína se encuentra asociado con producción de leche, mientras que el homocigoto BB está relacionado con porcentaje de proteína,  propiedades de coagulación y consistencia de cuajada (Bovenhuis et al1992; Ron et al 1994; Ng-Kwai-Hang 2001; Cardak 2005 y Halle et al 2008).

Diversidad Genética

El estudio de las caseínas lácteas en ganado holstein permitió identificar seis variantes  alélicas (Tabla 3).  Los alelos A y B de las alfa caseínas fueron los más frecuentes, mientras que los alelos B, C y D se presentaron en menor proporción. Además, independientemente de la proteína estudiada se obtuvieron valores de heterocigosidad observada inferiores o iguales a 0.38 (Tabla 4).

Al realizar el análisis de las frecuencias alélicas considerando cada zona, se encontró que la variante alélica A de la proteína α S₂ Caseína se encuentra fijada en el distrito de Pasto y cercana a la fijación en Pupiales (1.0 y 0.97 respectivamente).  Por otro lado, se observó mayor frecuencia de las variantes B y A de las proteínas α S₁ y β Caseínas, respectivamente, independiente de la zona estudiada (Tabla 5).  Adicional a estos resultados, se observó un déficit de heterocigotos para la α S₂ Caseína (Tabla 6).

Equilibrio Hardy-Weinberg y Desequilibrio de ligamiento

Al considerar los municipios de Pasto y Pupiales como una sola población, el análisis multilocus evidenció desviaciones del equilibrio H-W (P=0.0033).  Al analizar los datos de cada población por separado, los resultados de E H-W indicaron en Pasto (Tabla 7), desviaciones para la caseína α S₂ (P=0.00) y en Pupiales para las α S₂  y β-Caseínas (Tabla 8). 

 Por otra parte, considerando la población en general no se detectó desequilibrio de ligamiento (DL), (p<0.05), entre todos los pares de locus polimórficos, lo que evidencia la asociación aleatoria entre el genotipo de un cromosoma para un locus y su genotipo en el otro locus (Freeman & Herron, 2002).

Estructura genética

El análisis molecular de varianza indicó para la raza holstein del Trópico Alto de Nariño, ausencia de estructura genética equivalente a -0.15%   (FST=  -0.0015) (Tabla 9).  FST varía entre 0 y 1 pero en ocasiones, a causa de tamaños muestrales desiguales, pueden aparecer ligeros valores negativos (Lowe et al., 2004).

Los valores de FIS obtenidos, equivalentes a FIS= 0.0893, muestran la presencia de endogamia en las poblaciones provenientes de los dos distritos lecheros, explicando en parte las desviaciones respecto al equilibrio Hardy-Weinberg y el déficit de heterocigotos en la proteína α S2 Caseína (Tabla 6). 

Según Smith et al (1998), la endogamia máxima aceptable en un hato es de 6,25%, mientras que en este estudio fue aproximadamente igual a 8.94%, valor cercano al 9,7% de consanguinidad proyectado para la raza holstein en el 2020. La presencia de endogamia y la ausencia de estructura genética en los distritos pueden indicar la disminución en la eficiencia reproductiva de la raza holstein.

La endogamia evidencia alto parentesco entre individuos, por lo que llega a ser más probable que vacas y toros que son apareados entre ellos estén estrechamente relacionados (Hansen 2006).  Según este mismo autor, la mayoría de las consecuencias de la endogamia están ocultas y no se notan en un corto plazo, por lo que es notoria la pérdida económica de los productores consecuencia del incremento de abortos, la reducción en la fertilidad, la inhibición de resistencia a las enfermedades, además de disminuir la vida productiva de ganado lechero.  

La reducción de la fertilidad es la mayor consecuencia negativa de la endogamia, porque un alto porcentaje de embriones se desprenden y probablemente no son viables (Fioretti 2002).  La mayoría de los productores son inconscientes de que las vacas holstein de su hato tienen un porcentaje de endogamia más alto que el recomendado (Hernández  2000). Por esta razón y dado el elevado incremento de los apareamientos entre holstein del Trópico Alto de Nariño, la revisión de pedigree es esencial para programar los apareamientos, e incluso se hace necesario el uso de nuevos cruces que permitan aumentar el efecto de heterosis y así contrarrestar la depresión endogámica observada. 

Agradecimientos

Los resultados presentados en este documento hacen parte del proyecto “Identificación molecular de los genotipos de las fracciones proteicas de la leche en hembras bovinas donadoras y su relación con las variables productivas, reproductivas y de rendimiento quesero en el Trópico Alto de Nariño, suscrito entre el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, la Universidad de Nariño y la Cooperativa de productos lácteos de Nariño-Colácteos, entidades a las que expresamos nuestros más sinceros agradecimientos.  

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Received 14 March 2011; Accepted 25 April 2011; Published 19 June 2011

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