Frecuencias alélicas del gen Kappa caseína en la raza Holstein del trópico alto de Nariño – Colombia

C E Solarte-Portilla, C Y Rosero, J M Eraso, G L Zambrano, H Cárdenas* y W O Burgos**

Universidad de Nariño, Facultad de Ciencias Pecuarias – Grupo de Investigación “Producción y Sanidad Animal” A. A. 1175    
* Universidad del Valle, Departamento de Biología
**  Departamento de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia
csolarte@udenar.edu.co

Resumen

El objetivo de esta investigación fue estimar las frecuencias alélicas del gen de la Kappa-caseína (K-cs) en los bovinos de raza Holstein del trópico alto de Nariño - Colombia. El genotipo de cada animal se determinó molecularmente, mediante la técnica PCR-SSCP en 748 ejemplares de esta raza, distribuidos en tres distritos lecheros y 57 fincas localizadas en los distritos Pasto, Pupiales y Guachucal. La matriz de datos se analizó con el programa TFPGA (Tools  For Population Genetics Analisys).

Las frecuencias alélicas, tomando los tres distritos como una sola población, fueron  de 0.80 para el alelo A y 0.20 para el alelo B, la heterocigosidad observada fue de 27.9% y  no se encontró equilibrio Hardy – Weimberg (H - W) (P< 0.05). Cuando se consideró cada distrito como una población, se observó equilibrio H-W en todos ellos (P>0.05), lo  que indica que  por lo menos, a nivel de distrito, existe estructura genética para este gen.  La frecuencia del alelo A fue de 0.82; 0.75 y 0.80 y la heterocigosidad observada de 25.5%; 31.6% y 28.5% en Pasto, Pupiales y Guachucal, respectivamente. Estos valores se encuentran dentro de los rangos reportados por otros estudios para esta raza. 

Palabras clave: Colombia, Holstein, Kappa-caseína, PCR-SSCP

Allelic frequencies of Kappa casein gene in Holstein breed in Nariño - Colombia

Abstract

The aim of this research was to estimate Holstein’s allelic frequencies for Kappa casein gene in Nariño - Colombia.  The genotype of each animal was molecularly determined by the PCR- SSCP technique on 748 Holstein animals, which were distributed in three dairy zones and 57 farms located in Pasto, Pupiales and Guachucal. Matrix data were analyzed t with the TFPGA (Tools For Population Genetics Analysis) software in order to determine the allelic frequencies of all the animals. 

When all animals in the three zones were treated as one population, allelic frequencies were 0.80 for allele A and 0.20 for allele. Also a 27.9% of heterocigosity was observed and lack of Hardy – Weinberg equilibrium was noticed (P< 0.05). In each zone, results indicated that all populations were in Hardy-Weimberg equilibrium (P>0.05). According to these results it is possible to identify genetic structure at least in one of the zones. The allelic frequency for A was 0.82; 0.75 and 0.80 and the observed heterocigosity was 25.5%; 31.6% and 28.5%. in Pasto, Pupiales and Guachucal respectively.  All these values fall into the universal parameters for the Holstein breed. 

Key words: Colombia, Holstein, Kappa casein, PCR-SSCP

Introducción

La producción especializada de leche en el trópico alto del departamento de Nariño -Colombia, se basa en la raza Holstein, caracterizada por su  alto potencial genético para producir grandes volúmenes de leche. Si bien la alta producción constituye su mayor ventaja, lo que la convierte en la raza más utilizada en todo el mundo, la composición de su leche es pobre en grasa y proteína, comparada con otras razas (Munizaga et al 2004).

Esta situación debe analizarse cuidadosamente puesto que, bajo los actuales esquemas de mercadeo, el precio al productor en buena medida está determinado por la calidad higiénica y composicional de la leche. Igualmente, muchos  procesadores buscan alcanzar mayor eficiencia en la producción de quesos, donde el contenido de proteína, especialmente K-cs, resulta determinante para mejorar los rendimientos (Requena et al  2007).

El ganado  Holstein produce en promedio 3,5% de proteína en la leche y en la actualidad se intenta mejorar por selección este promedio. Para alcanzar esta meta es necesario tener en cuenta que en todas las razas la producción de proteína es un carácter cuya expresión está influenciada por factores ambientales como la dieta, la edad, el número y tercio de lactancia, el número de ordeños y por el genotipo del animal. (Requena et al 2007).

En consecuencia, para identificar los individuos con los genotipos más apropiados para la producción de proteína en la leche, bajo el esquema  de Mejoramiento Genético clásico se deben realizar  pruebas  de progenie, que por el intervalo generacional de los bovinos toma entre 6 y 7 años. Sin embargo, con la utilización de técnicas de la biología molecular es posible identificar desde los primeros estadios de vida los genotipos más favorables,  con lo que se acelera de manera notable el proceso de selección (Requena et al 2007).

En este estudio se presentan los resultados de la genotipicación mediante la técnica PCR-SSCP de 748 ejemplares de la raza Holstein y los análisis correspondientes al comportamiento de las frecuencias alélicas observadas en las variantes A y  B del gen de la  K-cs.  El estudio se llevó a cabo en tres distritos lecheros del trópico alto de Nariño – Colombia, región dedicada a la producción especializada de leche, donde la raza  Holstein alcanza un promedio de 3.2% de proteína y se requieren 11 litros de leche para producir un kilogramo de queso fresco (Cooperativa De Productos Lácteos de Nariño – Colácteos), cifra mayor que los estándares nacionales e internacionales (Avilés 2004).

La información obtenida en esta investigación constituye una importante herramienta para orientar el proceso selectivo en el trópico alto de Nariño, donde se adelanta un programa de Mejoramiento Genético, dirigido a la selección de los genotipos más adecuados a las condiciones propias de la zona.

Materiales y métodos 

La presente investigación se realizó en 57 fincas localizadas en los distritos lecheros de Pasto, Pupiales y Guachucal, en el departamento de Nariño, República de Colombia, correspondiente a la zona ecológica Bosque Pluvial Tropical (Evaluación de los recursos forestales mundiales 2000). Las coordenadas geográficas y  las principales características climáticas de cada distrito se indican en la Tabla 1.

Ubicación geográfica y descripción de los tres distritos

En la Figura 1, se indica la localización de los tres distritos lecheros en el trópico alto de Nariño.

Las fincas se seleccionaron al azar, independientemente del nivel tecnológico, que en la zona se clasifica como alto, medio y bajo. Dentro de las fincas, la muestra también se escogió aleatoriamente.

En este estudio se incluyeron únicamente animales de la raza Holstein, de los cuales el  8.77%  tienen registro en la Asociación Holstein de Colombia y 91.23% restante  corresponden a animales absorbidos por dicha raza sobre núcleos criollos locales, con rasgos fenotípicos predominantemente Holstein y comercialmente considerados como tales.  En  el 42.2% de los hatos se utiliza  inseminación artificial con semen importado de Estados Unidos, Canadá y Nueva Zelanda en su orden. El 18,8% utiliza inseminación artificial con  semen de  toros nacionales, hijos de padres Holstein extranjeros y  el 39% de las fincas utiliza monta natural con toros Holstein, nacidos en la región.

El número de fincas por distrito y el número de animales en cada finca se determinó  en proporción al total de fincas y de animales  por distrito, con base en el censo realizado por la Cooperativa De Productos Lácteos De Nariño-Colácteos en el año 2006. En  la Tabla 2 se indica el número de fincas y animales muestreados en cada distrito.

Toma de muestras de sangre

Se extrajeron 2 c.c. de sangre de la vena anocaudal de cada individuo y para su conservación se impregnaron en tarjetas FTA^® (Whatman Bioscience). Estas muestras fueron llevadas  al Laboratorio de Mejoramiento Genético Animal, ubicado en la Ciudadela Universitaria Torobajo de la Universidad de Nariño en la ciudad de Pasto - Colombia, La obtención del ADN se realizó usando el KIT  FTA^® de Whatman Bioscience y siguiendo las recomendaciones de la casa fabricante.

Determinación de las variantes alélicas

La genotipificación de cada ejemplar incluido en el muestreo se llevó a cabo mediante la técnica PCR-SSCP (Polimerase chain reaction- single strand conformation polymorphysm), descrita por  Barroso et al (1998), con pequeñas modificaciones realizadas en el laboratorio. Para la reacción en cadena de la polimeriza se utilizaron los siguientes componentes: primers: “Forward”  5`-TGT GCT GAG TAG GTA TCC TAG TTA TGG-3` y “Reverse” 5`-GCG TTG TCT TCT TTG ATG TCT CCTTAG-3;  2mM de Mgcl<sub>2</sub>; 0.2mM de dNTP`s; 2U de taq polimerasa para un volumen total de 20ul por muestra analizada. Para la amplificación de los fragmentos se utilizó un ciclo de cinco minutos a 94ºC; 35 ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 65ºC, dos minutos a 72ºC y finalmente, un ciclo de cinco minutos a 72ºC. La denaturación del producto PCR se llevó a cabo por 5 minutos a 94 ºC. El tiempo de separación electroforética fue de 16 horas, lográndose en ese lapso una observación correcta de los fragmentos amplificados del gen de la K-cs.

Por ser las variantes alélicas más estudiadas en la raza Holstein, previamente se identificaron los patrones de bandas de los alelos A y B con la técnica PCR-RFLP, igualmente descrita por Barroso et al (1998). Este patrón, indicado  en la Figura 2, también se utilizó para confirmar los genotipos obtenidos con la técnica PCR-SSCP.

Las muestras fueron corridas en presencia de un control negativo para asegurar la limpieza de la reacción de PCR-SSCP. La lectura de los geles se realizó visualmente, acorde con el patrón obtenido en el laboratorio (Figura 3) y se confirmaron con el lector de geles referencia GL-4151B Epidigicam.

Variables analizadas

Con el programa Tools For Population Genetics Analisys, TFPGA (Miller 1997) se estimaron las frecuencias alélicas de las variantes A y B del gen de la K-cs, las heterocigosidades observada y  esperada y las pruebas del equilibrio H-W para la población total y cada distrito.

Resultados y discusión 

La alta frecuencia del alelo A en los distritos de Pasto y Guachucal se explica por la selección indirecta realizada a favor de la característica volumen de leche por lactancia.  A este respecto, estudios llevados a cabo en varios países han encontrado que el alelo A está asociado con alta producción y baja calidad composicional de la leche en el ganado Holstein, especialmente en  cuanto a contenido proteico (Requena et al 2007).

En el distrito de Pupiales la situación fue  algo diferente,  ya que  se observó un  porcentaje de heterocigosidad mayor y una  menor frecuencia del alelo A. Estos resultados se explican, en parte, por el tipo de animal predominante en este distrito, que corresponde al  mestizo entre Holstein y el denominado “criollo”, lo que conduce a suponer razonablemente que el núcleo “criollo” posee frecuencias alélicas más altas para el alelo B y en consecuencia es necesario realizar  estudios multiloci para estas poblaciones locales y  caracterizarlas de modo más amplio.

En la tabla 3 se observa una frecuencia alta del alelo A siendo mayor en el distrito de Pasto (0.8247). 

El distrito de Pupiales presentó la frecuencia del alelo B (0.2481) y la Heterocigosidad observada mas alta (Ho=0.3158). Las pruebas de Fisher no mostraron desviaciones significativas de las proporciones esperadas por Hardy – Weinberg, sin embargo, estas desviaciones fueron significativas  cuando se juntaron los distritos como si fueran una población única. Esto sugiere que hay estructuración poblacional por lo menos a nivel de los distritos.

Las cifras de equilibrio por Distrito y la ausencia del mismo al considerar una solo población confirman la existencia de diferencias en el manejo genético de cada zona. En los Distritos de Pasto y Guachucal  la probabilidad de equilibrio es similar y muy cercana a la probabilidad de desequilibrio; en cambio en Pupiales el equilibrio es evidente. Las ganaderías con mayor grado de especialización se concentran en Pasto y Guachucal, donde se utiliza con mayor intensidad semen importado, a diferencia de Pupiales que es donde más se utiliza monta natural y el nivel de absorción de los núcleos criollos es menor.

También, en la tabla 3 se observa que el coeficiente de endogamia (f) oscila entre 0,127 y 0,156, valores mayores que los aceptados para especies domesticadas. Esto significa que los tres distritos están manejando niveles de endogamia equivalentes a los valores alcanzado por cruces recurrentes de medios hermanos (f =1/8). En términos de tamaño efectivo se podría decir que este es cercano a 4, Ne = 1/(2f). Este valor es crítico, en términos de la variabilidad genética representada en cada hato. (Smith et al  1998).

Según Smith et al (1998) la endogamia máxima aceptable en un hato es de 6,25%, en este estudio se estima que esta es aproximadamente igual al doble, valor que supera el 9,7% de consanguinidad proyectado para la raza Holstein en le 2020.

Los  altos valores de homocigosis confirman las altas tasas de endogamia Sin embargo,  aun existen genotipos heterocigotos, que dejan abierta la posibilidad de selección en los núcleos regionales

Las cifras obtenidas en  este estudio evidencian  la necesidad de reorientar los tipos de apareamiento, la elección de padres no emparentados  y  la aplicación de un proceso selectivo en donde se considere como factor importante el incremento de la frecuencia del alelo B para alcanzar los objetivos propuestos, especialmente en lo que se refiere al mejoramiento de los rasgos relacionados con la calidad de leche y el rendimiento quesero, donde el genotipo de kappa caseína tendrá la ponderación correspondiente en el índice para totalizar  el mérito genético de los candidatos a selección.

Consideraciones finales 

• Los resultados de esta investigación reafirman la necesidad de revisar y reorientar el proceso selectivo del ganado Holstein en el trópico alto de Nariño - Colombia, en procura de incrementar la calidad composicional de la leche, lo que podría lograrse mediante estrategias integrales, entre ellas el incremento de la  frecuencia génica del alelo B del gen de la K-cs, el cual está relacionado con un  mayor porcentaje de proteína en la leche y un mejor rendimiento en la producción de quesos, acorde con los resultados obtenidos en varios países y confirmados parcialmente en este programa de Mejoramiento Genético, aunque es necesario aclarar  que el genotipo para K-cs no puede considerarse  como el único criterio de selección para alcanzar los objetivos del programa  en la región.

Agradecimientos 

Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, CIAT, FEDEGAN, Colácteos y  la Universidad de Nariño, por la financiación de este trabajo que hace parte del Programa de Mejoramiento Genético,  asistido con marcadores de ADN, dirigido a la obtención de un modelo bovino lechero para el trópico alto de Nariño.

Referencias  

Avilés H 2004 Productores avanzan en la industrialización, Campo sureño. Chile. www.australtemuco.cl/site/apg/campo/pags/20040320230206.html

Barroso A, Dunner S and Cañón J 1998 Technical note: Detection of Bovine Kappa-casein variants A, B, C, y E by Means of Polymerase Chain Reaction-single strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP). Journal of Animal Science 76:1535-1538 http://jas.fass.org/cgi/reprint/76/6/1535

Cooperativa de Productos Lácteos de Nariño-Colácteos 2006 Inventario  ganadero.

Evaluación de los recursos forestales mundiales 2000 Zonas ecológicas de América del Sur BP. Capítulo 42: http://www.fao.org/DOCREP/005/Y1997S/y1997s1d.htm

Miller M P 1997 Tools for population genetic analyses (TFPGA) 1.3: A windows program  for the analysis  of allozyme and molecular population genetic data.  Computer software distributed by author.

Munizaga F G, Barrales V L y Valenzuela A L 2004 Desarrollo de un modelo para evaluar la factibilidad productiva y económica de la progenie resultante del cruzamiento de vacas Holstein Friesian con toros de las razas francesas Montbeliarde y Normando. Departamento de Ciencias Animales, pontificia Universidad Católica de Chile.

Requena F D y Agüera  E I  2007 Genética de la caseína de la leche en el bovino Frisón (Milk of casein of genetic in the Frison bovine). Volumen VIII, Nº 1:  http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n010107/010702.pdf

Smith  L A, Cassell B G and Pearson R E 1998 The effects of inbreeding on lifetime performance of dairy catle. Journal of Dairy Science 81:2729-2737 http://jds.fass.org/cgi/reprint/81/10/2729.pdf

Received 17 September 2008; Accepted 3 November 2008; Published 1 January 2009

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