Relación entre presión y volumen para el montaje de la técnica in vitro de producción de gas en Colombia

L A Giraldo, L A Gutiérrez*, J Sánchez* y P A Bolívar*

Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín. *Laboratorio de Biotecnología Ruminal (BIORUM),
*Departamento de Producción Animal, Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín.
conisilvo@epm.net.co

Resumen

La técnica de producción de gases in vitro ha generado gran interés en los últimos años, gracias al potencial para simular la cinética y la extensión de la fermentación ruminal y además para predecir la degradabilidad del alimento. El trabajo tuvo como objetivo establecer la ecuación, que correlaciona la presión (P) y el volumen (V) a partir de datos experimentales, como procedimiento inicial para la implantación de la técnica in vitro semi-automática de producción de gases en Colombia. Resultados provenientes de la fermentación de seis forrajes tropicales: heno de pasto angleton (Dichantium aristatum), pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum), pasto braquiaria (Brachiaria humidícola), la arbórea leguminosa acacia negra (Acacia decurrens), la leguminosa herbácea maní forrajero (Arachis pintoi) y la leguminosa arbustiva cratylia (Cratylia argentea), usando 15 horarios de fermentación in vitro: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 19, 24, 30, 36, 48, 72, 96 y 120 horas y tres réplicas por forraje, permitieron generar la ecuación que relaciona (P) y (V) a partir de 1015 datos: V (ml) = 0.208 (± 0.092) + 5.045 P (± 0.091) + 0.015 P² (± 0.021), (R²= 0.98); la cual permitió la implementación de la técnica in vitro semi-automática de producción de gases en el laboratorio de Biotecnología ruminal de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín.

Posteriormente, se utilizó la ecuación generada para un grupo de cinco forrajes tropicales, con el propósito de estimar varios parámetros de la fermentación ruminal in vitro, usando la técnica de gases, lo que permitió el uso la ecuación hallada para las condiciones del laboratorio.

Palabras claves: Degradabilidad ruminal in vitro, dinámica fermentativa, producción de gas in vitro, regresión lineal, técnica de gases

Relation between pressure and volume for the assembly of the  in vitro technique of gas production in Colombia

Abstract

The production technique of gas in vitro has generated great interest in the last years, thanks to the potential to simulate rumen kinetics and the extension of the ruminal fermentation and to predict the degradability of the feed. This research aimed to establish the equation that correlates the pressure (P) and the volume (V) from experimental data in order to  facilitate the introduction of the semi-automatic in vitro gas production technique in Colombia. Six tropical forages: Angleton (Dichantium aristatum), kikuyo (Pennisetum clandestinum), braquiaria (Brachiaria humidícola), the tree legume black acacia (Acacia decurrens), the herbaceous legume (Arachis pintoi) and the shrub legume cratylia (Cratylia argentea), 15 intervals of fermentation: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 19, 24, 30, 36, 48, 72, 96 and 120 h and three replicates of each forage, were used to generate the equation that relates (P) and (V).

The  equation was: V (ml) = 0.208 (± 0.092) + 5.045 P (± 0.091) + 0.015 P² (± 0.021) [R²=0.98].  Later the equation was applied to a group of five tropical forages to verify its usefulness to predict several parameters of the ruminal fermentation in vitro.

Keywords: Degradability ruminal in vitro, fermentative dynamics, gas technique, in vitro gas production

Introducción

Colombia, como en la gran mayoría de países tropicales, se caracteriza por poseer gran variedad de especies forrajeras de gran utilidad en la alimentación de rumiantes, de allí el afán por evaluar su calidad nutricional y la búsqueda constante de procedimientos precisos, sencillos y rápidos que permitan hacerlo.

La cinética de degradación ruminal puede estudiarse a través de técnicas que estiman la desaparición del material incubado con microorganismos ruminales, estas técnicas son denominadas gravimétricas e involucran estudios in vivo (in situ) e in vitro.

Las determinaciones in vivo son consideradas generalmente las más exactas y adecuadas para determinar el valor nutricional de los alimentos en rumiantes, pero su implementación y puesta en marcha, es un proceso laborioso y costoso, que requiere el empleo de grandes cantidades de alimento, la utilización de animales preparados quirúrgicamente (fistulados) y la disposición de instalaciones para su cuidado (Broderick 1994). Como alternativa, se han propuesto distintos métodos entre ellos los procedimientos in vitro para la estimación de la dinámica fermentativa ruminal, como es el caso de técnicas no gravimétricas. Dentro de éstas, la técnica de la fermentación ruminal in vitro, permite valorar la producción acumulativa de los gases producto de la fermentación con microorganismos ruminales y un medio de cultivo (Menke y Steingass 1988).

En una revisión reciente, Rymer et al 2005a indicaron que quienes primero propusieron y desarrollaron el principio para la determinación de la degradación/fermentación ruminal potencial de los alimentos por la medición del gas producido en cultivos en serie fueron McBee (1953) y Hungate (1966). Posteriormente se han hecho adaptaciones y modificaciones, primero por Trie et al (1970), después por Jouany y Thivend (1986), luego por Beuvink y Spoelstra (1992) y Beuvink et al (1992). A través del tiempo se han hecho muchas y variadas modificaciones. Incluso un dispositivo para medir el gas producto de la fermentación de los alimentos usando jeringas de vidrio fue desarrollado por Czerkaswski y Breckenridge (1975) en Gran Bretaña y sólo en 1979 se propuso y desarrollo el "Hohenheim Gas Test" en Alemania por Menke et al (1979). Finalmente, Theodorou et al (1994), proponen y desarrollan la técnica de la medición manual de la presión usando un trasductor de presión, conocida universalmente como MPT, por su sigla en inglés (Manual Pressure Trasducter).

La técnica MPT desarrollada por Theodorou et al (1994), se caracteriza por la lectura manual del volumen de gases producidos a través de una jeringa plástica graduada, que permite determinar la extensión y la cinética de degradación del alimento a través del volumen de gas producido durante el proceso fermentativo. Una de sus ventajas es que el curso de la fermentación y el papel de los componentes solubles del sustrato pueden ser cuantificados (Pell et al 1997), así como describir la cinética de fermentación en el rumen, además de conocer la tasa y extensión de la degradación de forrajes (Getachew et al 1998).

Por otra parte, con la técnica de gases es posible registrar la acumulación del volumen de gas estableciendo relaciones estequiométricas entre la producción de AGV y el volumen de gas (Blümmel y Becker 1997). Otras ventajas son su potencial para simular la cinética de la fermentación ruminal (Blümmel y Becker 1997; Getachew et al 1998; Sileshi et al 1996), y para predecir la digestibilidad in vivo (Blümmel y Ørskov 1993; Menke y Steingass 1988).

Igualmente, permite estimar la velocidad y extensión de la fermentación in vitro de fracciones de los alimentos. Así por ejemplo la desaparición de la FDN, se ha demostrado que está relacionada con la producción de gas (Nsahlai et al 1995). También Menke et al (1979) reportan alta correlación entre la digestibilidad de la MO in vivo y la producción de gas in vitro acumulada en 24 horas.

También la técnica de gases se ha comparado con otras técnicas como la in situ o de bolsa de nailón; Sileshi et al 1996 y López et al 1998 reportan correlaciones altas y significativas entre la tasa fraccional de desaparición de la MS in situ y la tasa fraccional de producción de gas efectuada in vitro utilizando la técnica MPT de producción de gases. Por otro lado, la técnica de producción de gas se ha utilizado como predictor del consumo voluntario de MS digestible (Liu et al 2002), en particular la tasa fraccional de degradación (Blümmel y Becker 1997).

No obstante las anteriores ventajas, la técnica de producción de gases tiene como desventaja la falta de uniformidad en las metodologías, lo que dificulta la comparación de resultados entre grupos de investigación (Williams 2000). De igual manera, la falta de uniformidad en las metodologías tiene que ver también con muchos efectos: efecto del venting durante la incubación (dejar o no escapar el gas después de su medición a ciertos intervalos de tiempo), efectos de cambios en la presión atmosférica afectados por la altitud, efectos de la agitación de la fermentación in vitro, efectos del tamaño de la muestra y su preparación, efectos del tipo de inóculo, efectos del uso de blancos, efecto de la composición del medio de cultivo, efectos de los aparatos usados y efectos de los diferentes sistemas de evaluación (Rymer et al 2005a), por todo lo anterior es, una tarea necesaria remediar esta situación para hacer un uso más generalizado de la técnica (Williams 2000). Aspecto que hace poco fue estudiado por Rymer et al (2005b), quienes encontraron fuertes diferencias entre aparatos, animales donadores de líquido ruminal y laboratorios en los perfiles de producción de gas, sin embargo es posible desarrollar factores de corrección para poder comparar los resultados entre diferentes laboratorios.

Actualmente, la producción de gas puede cuantificarse por sistemas totalmente automatizados (Pell y Schofield 1993), y por sistemas parcialmente automatizados dónde las lecturas se realizan manualmente usando transductores de presión conectados a un voltímetro digital, y una jeringa ensamblada que permita medir el volumen de gases producido en la lectura de la presión respectiva (Maurício et al 1999).

El interés en la aplicabilidad de la técnica, llevo a evaluar inicialmente el uso de la "ley de los gases" de Boyle y Gay-Lussac, para estimar la producción de gases durante la fermentación, en que: PG = Vs / Pa * Pt, siendo PG = producción de gases (ml), Vs = volumen de gases en la parte superior del frasco (ml), Pa = presión atmosférica (psi) y Pt = presión obtenida por el transductor (psi= libras por pulgada cuadrada), pero psi es una unidad de uso en Gran Bretaña, siendo más apropiado el kilopascal (kPa); 1 kPa es la presión ejercida por una masa de 10 g en 1 cm² de área, y es la unidad de presión de gas de uso más común y universal, y por tanto más apropiada para la técnica de producción de gas in vitro (Rymer et al 2005a).

Según la ley de Boyle y Gay-Lussac a una presión de 1 atm, se estima que una mol de gas ocupa 25.59 ml, a 39ºC. Si los laboratorios están localizados en áreas donde la presión atmosférica no es 1 atm, el respectivo ajuste debe ser realizado (Williams 2000).

Sin embargo, se comprobó que esta ley no considera la difusión de los gases en la fase líquida y por lo tanto, no es tan útil para estimar con certeza la producción de gases durante la fermentación en el interior de las botellas, cuando se usa el procedimiento MPT. Esta deficiente utilidad de la Ley de Boyle y Gay-Lussac se restringe debido a que al espacio entre la cabeza de la botella y la superficie del líquido de incubación (medio de cultivo + líquido ruminal), no funciona de modo perfecto para las varias y diferentes leyes de un gas ideal (Theodorou et al 1998).

En el comportamiento de los gases entre la interfase líquido-gases participan varias leyes (Boyle; Charles; Avogadro y Dalton), pero una sola no explica de manera satisfactoria el comportamiento de los gases con el uso de la técnica de gases en la fermentación in vitro. Adicionalmente, participan varios fenómenos que tienen que ver con el movimiento molecular, aceleración de las moléculas de gas, afectadas por la colisión entre ellas y con las paredes de las botellas y atracciones moleculares entre otras, como fenómenos orientados a tratar de explicar el comportamiento de los gases en el espacio entre la cabeza de la botella y la superficie del líquido en el sistema de fermentación in vitro usando las técnica de gases (Theodorou et al 1998).

Posteriormente como solución, se desarrolló una ecuación a partir de datos experimentales, que establece la relación entre la presión (P) y el volumen (V), (Maurício et al 1999) lo que permite eliminar las mediciones manuales del volumen de gas efectuadas a través de jeringas plásticas, como había sido propuesto por la técnica MPT de Theodorou et al 1994. Esta modificación en la técnica permite la reducción del error inherente a una medición manual, mayor velocidad en las lecturas y por ende la posibilidad de aumentar el número de botellas en los ensayos. Además permite que la cinética y específicamente el período inicial de fermentación (fase lag) se pueda describir con mayor precisión (Maurício et al 2003).

Esta metodología ha sido aplicada para el desarrollo de la técnica in vitro semi-automática de producción de gases, en la Universidad de Reading en Inglaterra con una altitud de 66 m, y en Brasil en Piracicaba-SP, en el Centro de Energía Nuclear en la Agricultura, CENA, a una altitud 780 m (Mauricio et al 1999) y en Belo Horizonte en el laboratorio de Nutrición Animal del Departamento de Zootecnia de la Escuela de Veterinaria UFGM a una altitud de 836 m en Brasil (Mauricio et al 2003). Al comparar los resultados obtenidos en estos trabajos se puede evidenciar la necesidad de la obtención de una ecuación propia para la predicción del volumen de gases a través de la presión, de acuerdo a la altitud de cada laboratorio.

El objetivo de este estudio fue establecer una ecuación de regresión entre presión y volumen a partir de datos experimentales, como procedimiento inicial para la implantación de la técnica in vitro semi-automática de producción de gas en el laboratorio de Biotecnología Ruminal de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Adicionalmente se planteo, la utilización de la ecuación generada, en la evaluación del la fermentación ruminal in vitro de cinco forrajes con composición química contrastante.

Material y métodos

Para este trabajo se utilizaron los siguientes forrajes: heno de pasto angleton (Dichantium aristatum), pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum), Braquiaria (Brachiaria humidícola), Acacia negra (Acacia decurrens), Maní forrajero (Arachis pintoi) y Cratylia (Cratylia argentea), secados previamente a 65ºC por 48 horas y molidos a tamaño de partícula de 1 mm.

En botellas de vidrio con una capacidad de 110 ml, gaseadas previamente con CO₂, se depositaron 0.5 g de cada una de las muestras a evaluar por triplicado, se incluyeron dos botellas las cuales solo contenían medio de cultivo (tampón) mas inóculo ruminal (blancos) por cada tiempo de incubación; se adicionaron 40 ml medio de cultivo a cada botella preparado según Goering y Van Soest, (1970), las botellas fueron cerradas con tapones de goma (14mm) y posteriormente almacenadas a 4ºC; al siguiente día, se removieron de la nevera a la incubadora a 39ºC; luego se inocularon con 10 ml de fluído ruminal cada botella, utilizando una jeringa plástica (recolectado de dos toros de raza criolla BON (Blanco Orejinegro) por medio de la filtración del contenido ruminal extraído a través de la cánula en un lienzo o muselina, depositado en un termo previamente calentado 39ºC y transportado inmediatamente al laboratorio, y allí filtrado nuevamente usando doble bolsa de nylon con un tamaño de poro de 53 µm, con el fin de retirar los sedimentos y residuos de pasto, gaseado permanentemente con CO₂ y mantenido a 39 ºC en un baño maría. La proporción de medio de cultivo (tampón) y el inóculo ruminal fue de 4:1 (Pell y Schofield 1993).

Cada botella fué gaseada constantemente con CO₂ hasta el momento de la inoculación del fluído ruminal, luego se sellaron herméticamente con tapones de caucho y anillos o agrafes de aluminio, con el fin de obtener así un medio anaerobio para la fermentación.

Para la determinación de la producción de gas, se llevaron a cabo incubaciones in vitro de todos los sustratos (forrajes en prueba), el gas producido durante el proceso de fermentación se midió siguiendo la técnica propuesta por Theodorou et al (1994). Todos los frascos, fueron incubados a una temperatura de 39ºC, con los siguientes tiempos fermentación anaeróbica: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 19, 24, 30, 36, 48, 72 y 96 horas (Mauricio et al 2003; Rosero et al 2003), tras los cuales se procedió a medir la presión de los gases acumulados en la parte superior de los frascos, con un transductor de presión tipo T453CEPA (Bailey y Mackey Ltd., Inglaterra) conectado a una válvula de tres salidas, la primera fué conectada a una aguja (0.6 mm), la segunda al transductor de presión y la tercera a una jeringa plástica que sirvió para la medición del volumen de gas producido, extrayendo el gas hasta llevar el transductor a cero, lo que resulta en el volumen de gas producido según el procedimiento descrito por Theodorou et al (1994) y Mauricio et al (1999). De esta manera, se cuantificó la producción acumulativa de gas, proveniente de cada tiempo de fermentación. El número de datos obtenidos durante la fermentación ruminal in vitro fue de 1015, los cuales se usaron para la estimación de la ecuación que relaciona presión y volumen, para ello se utilizó el programa Statistical Analysis Systems (SAS 2001), mediante el procedimiento PROG REG.

Posteriormente, pretendiendo utilizar los parámetros obtenidos con la ecuación de regresión generada anteriormente en el Laboratorio de Biotecnología Ruminal (BIORUM) a partir de la fermentación ruminal in vitro usando la técnica de gases, se estimó la producción de gas acumulada, la tasa acumulativa de producción de gas, el volumen de gas producido por mg de materia seca (MS) y materia orgánica (MO) degradada, se estudio la correlación entre volumen de gas producido (ml), construcción de ecuaciones que permitan predecir la degradación in vitro de la MS y la MO con base en el volumen de gas producido y la degradación de la materia seca (DMS) y la materia orgánica (DMO), a los siguientes tiempos de fermentación (6,12, 24, 48, 72 y 96 horas), para los forrajes: kikuyo (Pennisetum clandestinum), brachiaria (Brachiaria humidícola), angleton, (Dichantium aristatum), morera (Morus alba) y quiebrarrigo (Trichanthera gigantea), todos recolectados en regiones con condiciones edafoclimáticas diferentes a los usados para estimar la ecuación que relaciona la presión y volumen de gas, así como a edades de rebrote diferentes.

Para la determinación de la MS y la MO degradada, el contenido de las botellas pertenecientes a los tiempos de degradación, (6,12, 24, 48, 72 y 96 horas), fue filtrado con la ayuda de un embudo de cerámica, una bomba de vacío y papel filtro con un tamaño de poro de 0.5 mm. Luego se procedió al secado de los papeles filtro con los residuos de las muestras en estufa de aire forzado a una temperatura de 65C^o durante 48 horas, posteriormente se pesaron utilizando una balanza de precisión. La determinación de la materia orgánica (MO) se realizó mediante combustión de 2g de cada forraje sin fermentar y de los residuos de la fermentación después de determinar la materia seca a una temperatura de 600°C por tres horas en una mufla (AOAC 1984). Este procedimiento se realizó con el propósito de cuantificar la degradación de los forrajes en evaluación y tener controles que permitieran conocer la degradación en algunos tiempos de fermentación (Theodorou et al1994). Los porcentajes de degradación de MS y MO en cada tiempo de incubación se calcularon con la siguiente fórmula:

Resultados

En el presente trabajo se obtuvo la ecuación que relaciona presión y volumen a partir de 1015 datos experimentales, resultado de la fermentación de seis especies forrajeras (Figura 1).

Los valores de presión variaron entre 0.27 a 34.9106 kPa y los de volumen de gas entre 1.0 y 27.0 ml. La ecuación encontrada para los datos obtenidos fue: V (ml) =0.208 (± 0.092) + 5.045 P (± 0.091) + 0.015 P² (± 0.021), (R²= 0.98). Ecuación de regresión cuadrática que fue seleccionada respecto a la lineal, puesto que el coeficiente de determinación fue igual, lo mismo que la significancia estadística del intercepto y la pendiente (p<0.0001), pero el cuadrado medio del error (CME) fue distinto (lineal 12586 y 6293 cuadrática), por lo que el criterio de escogencia fue el menor CME.

Al utilizar la ecuación generada anteriormente con el propósito de ponerla en práctica, para un grupo de cinco forrajes tropicales: kikuyo (Pennisetum clandestinum), brachiaria (Brachiaria humidícola), angleton (Dichantium aristatum), morera (Morus alba) y quiebrarrigo (Trichanthera gigantea), se estimaron varios parámetros de la fermentación ruminal in vitro, usando la técnica de gases.

En la tabla 1, se muestra la composición química en porcentaje de proteína cruda (PC), fibra detergente neutro (FDN), fibra ácido detergente (FDA) y cenizas de los forrajes de kikuyo, heno de angleton, humidícola, morera y quiebrabarrigo. Como se puede observar, existe una alta diferencia entre los forrajes evaluados. El contenido de PC en varía entre 3.9 (heno de Angleton) y 24.77 (morera), el FDN entre 33.55 (morera) y 77.58 (B. Humidícola). En cuanto a la fracción FDA el quiebrabarrigo posee el valor más alto con 41.66% y el Kikuyo el valor más bajo (26.4%); las cenizas varían entre 5.24 y 23.12%.

El forraje que presentó el mayor volumen de gas fue el pasto kikuyo, mientras que el quiebrabarrigo presentó el menor volumen durante todo el período de evaluación. El Brachiaria produjo menos gas que el pasto kikuyo y la morera hasta las 24 horas, horario en el cual tiene una producción similar a la morera de 90.64 ml y en el último horario es similar a la del Kikuyo (162.59 ml). Por otro lado, la morera disminuye la producción de gas a partir de las 24 horas hasta el final de la fermentación, siendo menor incluso que la del heno de angleton (117.40 Vs 137.39 ml). El volumen acumulado estimado por la ecuación para los forrajes kikuyo, bracharia, angleton, morera y quiebrabarrigo en general, muestran una tendencia muy marcada en forma de asintótica (Tabla 2).

Todos los forrajes evaluados presentan incrementos de volumen de gas a través del tiempo, presentando diferentes curvas de producción; aunque en términos generales, se evidencia una alta producción de gas en los primeros horarios de fermentación, posteriormente disminuye y en algunos forrajes la producción se estabiliza.

La tasa acumulativa de producción de gas para cada uno de los recursos evaluados en los diferentes horarios de fermentación, muestra como las mayores tasas fueron obtenidas entre las 2 y las 4 horas de fermentación, factor probablemente ligado a la fermentación de los carbohidratos solubles, observándose gran diferencia entre forrajes. Así mismo se evidencia como entre los períodos de fermentación de 6 a 12 horas se presenta un aumento de la tasa de producción de gases, que probablemente está relacionada a la fermentación de los carbohidratos fibrosos o estructurales. El kikuyo presentó la mayor tasa de fermentación, seguido de la morera. El heno de angleton y la brachiaria humidícola, presentaron un pico de producción muy similar, mientras que el quiebrabarrigo mostró menor tasa de producción de gas producto de su fermentación (Figura 2).

Por el contrario, el quiebrabarrigo presentó la menor producción de gas (Figura 2). Lo anterior indica que en este horario se presenta la fermentación de la fracción soluble de todos los forrajes (Cone et al 1997), a partir de este horario y hasta las 4 horas de incubación hay un descenso brusco, en el cual empieza la fermentación de los carbohidratos potencialmente degradables (FDN), posteriormente se produce una tasa de fermentación constante hasta llegar a ser casi nula para todos los forrajes, que correspondería a la fracción indigestible de la materia seca.

El volumen de gas producido a las 96 horas por mg de MS y MO degradada, para cada uno de los forrajes, puede ser observado en la tabla 3. En el quiebrabarrigo no se realizó el estimado de la degradación de la MS y la MO porque en el proceso de filtrado se usó papel de filtro y bomba de vacío y en este caso las partículas quiebrabarrigo por su forma y consistencia no filtraron de forma normal, resultando en datos imprecisos y poco fiables, por ello no se incluyeron en los análisis a partir de la estimación de la degradabilidad de la MS.

Los valores de gas producido por la fermentación in vitro de la MS variaron entre 0.39 y 0.49 ml/mg de MS, en cambio la MO esta entre 0.52 y 0.70 ml/mg de MO. El forraje de B. humidícola, fue el material que produjo mayor cantidad de gas por mg de MS y MO degradada, mientras que la morera tuvo la menor producción, mientras que el forraje de brachiaria tuvo el mayor volumen de gas tanto para la MS como para la MO, lo cual coincide con un mayor contenidos de FDN en este recurso forrajero.

En las tablas 4 y 5 se muestra la degradación de la MS y MO respectivamente, de cada uno de los forrajes evaluados, en seis tiempos de degradación. La degradación de la MS a las 96 horas varia entre 64.50% para el heno de angleton y 81.26% para el kikuyo. La morera y kikuyo tienen un comportamiento semejante en los primeros horarios (entre 6 - 24 horas), con una baja degradación entre horarios. Mientras que la Brachiaria humidícola y el heno de angleton presentan alta degradación entre los diferentes horarios.

La degradación de la MO se encuentra entre 43.69% y 65.21% siendo el kikuyo el forraje que presenta la mayor degradación, mientras que el heno de angleton la menor.

Las correlaciones entre el volumen de gas producido y el porcentaje de degradación de la MS o de la MO, para determinar la existencia de relación entre estas tres variables, para cada uno de los forrajes involucrando todos los tiempos de fermentación se muestran en la tabla 6.

Las ecuaciones de regresión, que predicen la degradación de la MS y la MO a partir del volumen de gas producido durante la incubación in vitro se presentan en la tabla 7.

Se observa como las ecuaciones con mayor coeficiente de determinación (R²), son las correspondientes al heno de Angleton y B. humidícola, por lo que permiten una mejor estimación de la degradación de la MS y la MO; para el caso del kikuyo la ecuación correspondiente a la degradación de la MO presenta mejor R² que la de la MS. Sin embargo en todos los forrajes los coeficientes de determinación, son altos (mayores de 0.79), lo cual indica el alto porcentaje de explicación de las variaciones en los datos obtenidos de la degradación in vitro de la MS y la MO con base en el volumen de gas producido en los forrajes, excepto para la morera que muestra un coeficiente de determinación medio (0.51).

Para las gramíneas kikuyo, brachiaria y angleton, los coeficientes de regresión son altos y medio para la arbórea morera.

Discusión

Como lo sugiere Mauricio et al (1999), para la implantación de la técnica semi-automática de producción de gases en un laboratorio, es necesario la obtención de una ecuación que permita la predicción del volumen a través de la presión, de acuerdo con la altitud de cada laboratorio.

Los valores de presión encontrados, se ubican dentro de las recomendaciones de Theodorou et al (1994), quienes verificaron que valores de presión arriba de 7,0 psi causan inestabilidad en la correlación entre las variables.

La ecuación encontrada que relaciona la presión y el volumen de gas en el proceso de fermentación ruminal in vitro para los forrajes tropicales evaluados, difiere de las ecuaciones obtenidas en otros laboratorios como por ejemplo en Brasil en el CENA [V (ml) = 0.56 (± 0.05) + 3.61 P (± 0.035) + 0.18 P² (± 0.004), (R²= 0.98)] y en Belo Horizonte [V (ml) = -0.004 (± 0.06) + 4.43 P (± 0.043) + 0.051 P² (± 0.007), (R²= 0.99)]. Al igual que en Inglaterra [V (ml) = 0.18 (± 0.08) + 3.69 P (± 0.052) + 0.08 P² (± 0.007), (R²= 0.99)]. Estas diferencias probablemente están directamente relacionadas a la altitud de cada laboratorio: 836 m en Belo Horizonte, 780 m en Piracicaba, 66 m en Inglaterra-Reading (Mauricio et al 2003) y en Medellín 1526 m.

Belo Horizonte (UFMG) y Piracicaba (CENA) presentan altitudes próximas, por lo cual las ecuaciones difieren aparentemente respecto a los valores de los componentes de la ecuación (p.e. intercepto de 0.004 para la UFMG y 0.56 para el CENA). Sin embargo, para 6.9 kPa de presión el valor estimado de volumen en la UFMG fue de 4.38 ml y para el CENA de 4.35 ml. (Mauricio et al 1999). Al comparar los resultados obtenidos en tres laboratorios referenciados anteriormente, el comportamiento del volumen de gases producido, respecto a la altura sobre el nivel del mar se mantuvo, incluyendo el Laboratorio de Biotecnología Ruminal, así a mayor altitud, mayor volumen de gases (Inglaterra 1 kPa = 27.25 ml; UFMG 1 kPa = 30.22 ml y Medellín 1 kPa = 36.36ml).

Para el volumen de gas producido por las distintas especies de forrajes tropicales utilizados para validar la ecuación encontrada, la literatura reporta como la composición química de los forrajes tiene efecto sobre el volumen de gas producido, la tasa máxima de producción de gas y el tiempo en que se alcance la fermentación ruminal in vitro. Nsahlai et al (1995), han demostrado que la producción de gas está relacionada con la degradación de la FDN. Al respecto Pell et al (1997) encontraron que la relación entre ambos conceptos es lineal, por lo que hay una tendencia al aumento de la producción de gas en aquellos forrajes donde el contenido de FDN es mayor. Lo anterior coincide con lo encontrado en este estudio, donde el forraje con mayor producción de gas total es Brachiaria humidícola siendo su contenido de FDN el mas alto (77.58%), sin embargo debe tenerse presente que esta respuesta no siempre es así, recientemente (Giraldo et al 2004a), reportan para el kikuyo (63% FDN), una degradación de la pared celular (DFDN) de 41.3% y una producción de gas de 59.2 ml/0.5 gMS a las 24h de fermentación, en cambio para el angleton (73.6% FDN), la DFDN fue de 40.8% y el volumen de gas a las 24 h de incubación fué 68.4 ml/0.5 gMS, variaciones debidas posiblemente al manejo impuesto de la pastura respecto a la edad de rebrote, particularmente en forrajes tropicales.

Estas variaciones se evidencian mucho más cuando comparamos los ácidos grasos volátiles (AGV), producto de la fermentación ruminal. Al aplicar la enzima fibrolítica (celulasa) a los forrajes kikuyo y angleton, se modificó la fermentación ruminal in vitro, aumentando los AGV totales (P<0.05) de 1911 (tratamiento sin celulasa) a 2120 µmol (tratamiento con celulasa), y de 1781 a 2216 µmol (P<0.05) para los dos forrajes respectivamente, a pesar de contener el forraje de kikuyo menor pared celular (63%) que el angleton (73.6%), (Giraldo et al 2004b), evidenciando variaciones debidas a características químicas intrínsicas de la pared celular relacionadas con la especie de forraje.

Los valores para las tasas acumulativas de producción de gas encontradas para todos los forrajes, de acuerdo a su composición química, coincide con lo encontrado por Machado et al (2003), quienes reportan que los forrajes con menor contenido de FDN tienen tasas de producción de gas mas altas y obtenidas en menor tiempo de fermentación. Ello es debido a que los pastos con mayor valor nutritivo muestran todas las condiciones para una colonización y degradación eficiente por los microorganismos, haciendo que se presente mayor y más rápida fermentación (Nogueira et al 2000). Sin embargo, no siempre un mayor volumen de gas se asocia a una mayor degradación, se ha propuesto (Blümmel y Bullerdieck 1997) que la relación substrato degradado (mg) con el gas producido (ml), coeficiente llamado factor de partición (FP), puede reflejar la variación en la producción de la biomasa microbiana, pero este factor disminuye con el tiempo de incubación, en diferentes leguminosas y henos de gramíneas, cuando bajaron su FP de 11; 4.5; 3.9 y 3.7 para 6; 24; 48 y horas de fermentación (López et al 1998).

Liu et al (2002) reportan una producción de gas/mg de MS a las 96 horas para la morera superior al encontrado en este trabajo. La menor producción de gas, puede ser explicada, puesto que la muestra utilizada estuvo compuesta por tallos tiernos y hojas, mientras que en el experimento realizado por Liu et al (2002), la muestra estuvo compuesta únicamente por hojas, por lo tanto se espera una mayor concentración de carbohidratos solubles y proteína rápidamente fermentable.

Por otra parte, García y Giraldo (1990) determinaron la degradabilidad in situ del pasto kikuyo de 45 días de rebrote a las 48 y 60 horas de incubación intraruminal de 58.7% y 63.3% respectivamente, siendo muy similar el valor de las 48 horas con el encontrado en este trabajo.

Liu et al 2003, reportan una degradabilidad in situ en ovejas, para la morera a las 48 horas de incubación de 62.1% valor similar al encontrado en este trabajo utilizando la técnica in vitro (60.40%), estos autores también reportan una degradación de la MO para la Morera de diferentes procedencias y épocas del año entre 58.4% y 71.9%, valores superiores a los encontrados en este estudio, diferencias debidas posiblemente a diferencias en el estado de madurez y a distintas proporciones de hojas y tallos en las muestras de forraje analizadas.

Los valores de la relación y la significancia estadística semejantes entre la producción de gas in vitro y la degradabilidad los alimentos, han sido previamente reportadas por Chenost et al (1997) y Fernández-Rivera, (1998). López et al (1998) encontraron coeficientes de correlación de Pearson entre las técnicas ruminal in situ (bolsa de nylon) y la técnica in vitro (producción de gases) de: 0.78, 0.88, 0.88 y 0.81 (p<0.01) para la extensión de la fermentación de seis henos a las 6, 24, 48 y 72 horas de incubación. Otros autores han reportado resultados semejantes; Apori et al(1998), observaron una relación positiva entre la producción de gas in vitro y la degradabilidad in situ de la MS. Adicionalmente, Susmel et al (1998) obtuvieron una relación positiva entre el volumen, la producción de gas total y los parámetros que describen la curva de degradabilidad in situ.

López et al (1998) reportan varias regresiones lineales entre la producción de gas (ml por 200 mg de MS incubados) y la desaparición de la MS in situ a las 6, 24 y 72 horas de incubación para siete forrajes provenientes de gramíneas y cuatro de leguminosas, con R² entre 0.61 y 0.71, ecuaciones que permiten predecir la degradabilidad de la MS in situ en base a la producción de gas in vitro, usando la técnica de gases.

Conclusiones

• La información obtenida permitió la obtención y la utilización de la ecuación entre volumen y presión, para la instalación de la técnica in vitro semi-automática de producción de gases de acuerdo a la altitud del laboratorio de Biotecnología Ruminal del Departamento de Producción Animal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, que finalmente permitirá mayor rapidéz en las lecturas durante la fermentación y menor intervalo entre una lectura y otra por botella, favoreciendo así la mayor precisión en la descripción del perfil de fermentación ruminal simulado por la técnica e incrementando el número de muestras analizadas por experimento.

Agradecimientos

A la División de Investigaciones Medellín (DIME), de la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, la financiación del presente trabajo.

Referencias

AOAC 1984 Official Methods of Analysis of the Association of Analytical Chemists (14 ^th edition).

Apori S O, Castro F B, Shand W J and Orskov E R 1998 Chemical composition, in sacco degradation and in vitro gas production of some Ghanaian browse plants. Animal Feed Science and Technology 76:129-137

Beuvink J and Spoelstra S 1992 Interactions between substrate, fermentation end-products, buffering systems and gas production upon fermentation of different carbohydrates by mixed rumen microorganisms in vitro. Applied and Environmental Microbiology 37: 505-509.

Beuvink J, Spoelstra S and Hogendorp R 1992 An automated method for measuring time course of gas production of feedstuffs incubated with buffered rumen fluid. Netherlands Journal of Agricultural Sciences 40:109-119.

Blümmel M and Becker K 1997 The degradability characteristics of fifty-four roughages and roughage neutral detergent fibres as described by in vitro gas production and their relationship to voluntary feed intake. British Journal of Nutrition 77:757-768. http://docstore.ingenta.com/cgi-bin/ds_deliver/1/u/d/ISIS/28785584.1/cabi/bjn/1997/00000077/00000005/art00010/F4EC5847DABD54F11146571540F39977C98A71B855.pdf?link=http://www.ingentaconnect.com/error/delivery&format=pdf

Blümmel M and Bullerdieck P 1997 The need to complement in vitro gas production measurements with residue determinations from in sacco degradabilities to improve the prediction of voluntary intake of hays. Animal Science 64: 71-75.

Blümmel M and Ørskov E R 1993 Comparison of in vitro gas production and nylon bag degradability of roughage in predicting feed intake in cattle. Animal Feed Science and Technolology 40:109-119.

Bolívar P A y Sánchez J 2005 Determinación de la cinética fermentativa in vitro de diferentes recursos forrajeros para rumiantes. Tesis Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín.

Broderick G A 1994 Quantifying forage protein quality. In: G.C Fahey, Jr. (Editors) Forage Quality, Evaluation and Utilization. American Society of Agronomy Inc., Crop Science Society of America Inc and Soil Science Society of America Inc., Madison (USA). 200-228.

Chenost M, Deverre F, Aufrère J and Demarquilly C 1997 The use of gas-test technique for predicting the feeding value forage plants. In : E R Deaville, E Own, A T Adesogan, C Rymer, J A Huntington and L J Lawree (Editors). In vitro technique for measuring nutrient supply to ruminants. BSAS Occasional Publication No. 22. Edimburgh, Scotland

Cone J, Van Gelder A and Driehuis F 1997 Description of gas production profiles with a three-phasic model. Animal Feed Science and Technology 66: 31-45.

Czerkaswski J and Breckenridge G 1975 New inhibitors of methane production by rumen micro-organisms. Development and testing of inhibitors in vitro. British Journal of Nutrition 34: 429-444.

Fernández-Rivera S 1998 Relationships between gas relase in vitro and in vivo quality measures of tropical forrages. In vitrotechniques for measuring nutrient supply to ruminants. In: E R Deaville, E Own, A T Adesogan, C Rymer, J A Huntington and L J Lawree (Editors). In vitro technique for measuring nutrient supply to ruminants. BSAS Occasional Publication No. 22. Edimburgh, Scotland

García J A y Giraldo L O 1990 Degradabilidad in situ de materia seca, almidón y proteína bruta en algunos recursos alimenticios. Medellín 1990. 42 p. Tesis Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín. 42 p.

Getachew G, Blümmel M, Makkar H and Becker K 1998 In vitro gas measuring techniques for assessment of nutritional quality of feeds: a review. Animal Feed Science and Technology 72: 261-281.

Giraldo L A, Ranilla M J, Tejido M L and Carro M D 2004a Effects of enzyme application method on in vitro rumen fermentation of tropical forages. Journal of Animal Feed Science 13 (Supplement 1) 63-66.

Giraldo L A, Ranilla M J, Tejido M L and Carro M D 2004b Effect of exogenous fibrolytic enzymes on in vitro rumen fermentation of tropical forages. Journal Animal Feed Science 13 (Supplement 1) 67-70.

Goering M and Van Soest P 1970 Forage fiber analysis (apparatus, reagents, procedures and some applications). Agricultural Handbook, US Department of Agriculture. 379 p.

Hungate R 1966 The Rumen and its Microbes. Academic Press, New York, NY, USA.

Jouany J and Thivend P 1986 In vitro effect of avoparcin on protein degradability and rumen fermentation. Animal Feed Sciences and Technology 15:215-229.

Liu J X, Jun Y, Yan B, Yu J, Shi Z and Wang X 2003 The nutritional value of mulberry leaves and their use as supplement to growing sheep fed ammoniated rice straw. FAO Electronic Conference on mulberry for animal production (Morus1-L). http://www.fao.org/ag/aga/AGAP/FRG/Mulberry/Papers/HTML/Jianxin.htm

Liu J X, Susenbeth A and Südekum K 2002 In vitro gas production measurements to evaluate interactions between in treated and chemically treated rice straw, grass hay and mulberry leaves. Journal Animal Science 80: 517-524. http://jas.fass.org/cgi/reprint/80/2/517

López S, Carro M, González J and Ovejero F 1998 Comparación of different in vitro and in situ methods to estimate the extent and rate of degradation of hays in the rumen. Animal Feed Science and Technology 73:99-113.

Machado J., González R, Barrios U y Fondevila M 2003 ITEA. X Jornadas sobre Producción Animal. Determinación de la fermentación microbiana de gramíneas y leguminosas forrajeras mediante la producción de gas in vitro. Zaragoza. p 28-30.

Maurício R, Mould F, Dhanoa M, Owen E and Channa K 1999 A semi-automated in vitro gas production technique for ruminants fedstuff evaluation. Animal Feed Science and Technology 79: 321-330.

Maurício R, Pereira L, Gonçalves L and Rodriguez N 2003 Relação entre pressão e volume para implantação da técnica in vitro semi-automática de produção de gases na avaliação de forrageiras tropicais. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia 55 (2):216-219. http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0102-09352003000200014&lng=es&nrm=iso

McBee R 1953 Manometric method for the evaluation of microbial activity in the rumen with application to utilization of cellulose and hemicelluloses. Applied and Environmental Microbiology 1: 106-110.

Menke K, Raab L, Salewski A, Steingass H, Fritz D and Schneider W 1979 The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro. Journal Agricultural Science (Cambridge) 93:217-225.

Menke K H and Steingass H 1988 Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid. Animal Research Development 28: 7-12.

Nogueira J, Fondevila M, Barrios A and Gonzáles M 2000 In vitromicrobial fementation of tropical grasses at an advanced maturity stage. Animal Feed Science and Technology 83: 145- 157.

Nsahlai I, Umunna N and Negassa D 1995 The effect of multi-purpose tree digesta on in vitro gas production from napier grass or neutral-detergent fibre. Journal of the Science of Food and Agriculture 69: 519-528

Pell A, Doane P and Schofield P 1997 In vitro digestibility and gas production. In: Simpósio sobre Tópicos Especiais em Zootecnia, Lavras, MG, p.109 - 132. http://www.sbz.org.br/anais1997/Simp/palest7.pdf

Pell A and Schofield P 1993 Computerized monitoring of gas production to measure forage digestion in vitro. Journal Dairy Science 76:1063-1073. http://jds.fass.org/cgi/reprint/76/4/1063

Rosero R, Simões E de O, Gonçalves L, Rodríguez N, Rodríguez J A 2003 Modelos matemáticos para estimar os parámetros de degradação de sorgo através das curvas de produção de gás. Pasturas Tropicales 25: 2-9. http://66.249.93.104/search?q=cache:NRPj0eP-e_YJ:www.ciat.cgiar.org/forrajes/pdf/pasturas_tropicales_2003/pt_25_1_2_9.pdf+Modelos+matem%C3%A1ticos+para+estimar+os+par%C3%A1metros+de+degrada%C3%A7%C3%A3o+de+sorgo+atrav%C3%A9s+das+curvas+de+produ%C3%A7%C3%A3o+de+g%C3%A1s&hl=fr&gl=fr&ct=clnk&cd=1&client=firefox-a

Rymer C, Huntington J, Williams B and Givens D 2005a In vitro cumulative gas production techniques: History, methodological considerations and challenges. Animal Feed Science and Technology 123-124: 9-30.

Rymer C, Williams B, Brooks A, Davies D and Givens D 2005b Inter-laboratory variation of in vitro cumulative gas production profiles of feeds using manual and automated methods. Animal Feed Science and Technology 123-124: 225-241.

Sileshi Z, Owen E, Dhanoa M, Theodorou M 1996 Prediction of in situ rumen dry matter disappearance of Ethiopian forages from an in vitro gas production technique using a pressure transducer, chemical analyses or in vitro digestibility. Animal Feed Science and Technology 61:73-87.

Statistical Analysis Systems SAS 2001 User´s Guide. Statistics. Statistical Analysis Systems Institute. Inc., Cary, NC.

Susmel P, Mills C, Spanghero M and Stefanon B 1998 The prediction of the nutritive value abd degradability of Mediterranean forages by in vitro gas production. Zootecnie Nutrizione Animale 21:135-142.

Theodorou M, Lowman R, Davies Z, Cuddeford D and Owen E 1998 Principles of techniques that rely on gas measurement in ruminant nutrition. In: E R Deaville, E Own, A T Adesogan, C Rymer, J A Huntington and L J Lawree (Editors). In vitro technique for measuring nutrient supply to ruminants. BSAS Occasional Publication No. 22. Edimburgh, Scotland 55-63.

Theodorou M, Williams B, Dhanoa M, McAllan A and France J 1994 A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feed. Animal Feed Science and Technology 48:185-197.

Trie J, Hale W and Theurer B 1970 Effect of grain processing on in vitro gas production. Journal Animal Science 30:825-831.

Williams B 2000 Cumulative gas production techniques for forage evaluation. In: Givens D I, Owen E, Omed H M, Axford, R F E (Editors), Forage Evaluation in Ruminant Nutrition. CAB International, Wallingford. p189-213.